miR-496靶向Wnt-β-catenin通路抑制骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：研究骨肉瘤中 miR-496與β-catenin的表達水平，分析 miR-496是否與β-catenin結(jié)合，探討miR-496靶向Wnt/β-catenin通路抑制骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　方法：本研究首先通過miRwalk和miRanda生物信息學(xué)軟件分析，尋找能與靶基因β-catenin(β-鏈蛋白，CTNNB1)結(jié)合的miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20個miRNAs可能是β-catenin的潛在靶miRNAs；進一

2、步分析發(fā)現(xiàn)，其中，miR-496與β-catenin結(jié)合特異性最好、穩(wěn)定性最強。在骨肉瘤組織和瘤旁骨纖維化組織中，通過qRT-PCR檢測miR-496表達，Western blot檢測β-catenin的表達，分析miR-496和β-catenin表達之間的關(guān)系；在不同轉(zhuǎn)移潛能的骨肉瘤細胞株中qRT-PCR檢測miR-496的表達，Western blot檢測β-catenin及CyclinD1、MMP-7表達，分析miR-496和β-

3、catenin及CyclinD1、MMP-7表達之間的關(guān)系；合成miR-496 mimics、點突變序列（PM）、Scramble，分別轉(zhuǎn)染MG63骨肉瘤細胞，qRT-PCR檢測miR-496在不同細胞株中的表達，western blot檢測β-catenin及CyclinD1、MMP-7表達，分析miR-496表達和β-catenin及CyclinD1、MMP-7表達之間的相關(guān)性；Transwell實驗檢測miR-496轉(zhuǎn)染前后骨肉瘤

4、細胞轉(zhuǎn)移能力變化。
　　結(jié)果：（1）生物信息學(xué)方法預(yù)測到與CTNNB1結(jié)合的靶miRNAs有20個；其中，miR-496與CTNNB1的結(jié)合穩(wěn)定性最高，特異性最好。
　　（2）骨肉瘤組織中miR-496低表達，而瘤旁骨纖維化組織中miR-496高表達，兩者之間的表達水平有顯著性差異（P＜0.01）；骨肉瘤組織中β-catenin高表達，瘤旁骨纖維化組織中β-catenin低表達，兩者之間的表達水平有顯著性差異（P＜0.01）

5、。miR-496與β-catenin表達呈負相關(guān)，miR-496可能抑制β-catenin表達。（P＜0.01）。
　?。?）高轉(zhuǎn)移細胞株SOSP-9607中miR-496低表達，β-catenin、CyclinD1、MMP-7均高表達；低轉(zhuǎn)移細胞株U-2OS中miR-496高表達，β-catenin、CyclinD1、MMP-7均低表達，miR-496和三個蛋白的表達水平在不同轉(zhuǎn)移細胞系中有顯著性差異（P＜0.01）。miR-4

6、96可調(diào)控β-catenin的表達水平，而β-catenin表達水平與CyclinD1、MMP-7正相關(guān)，可能與骨肉瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　?。?）MG63-miR-496 mimics細胞株中miR-496表達增高，而β-catenin表達下調(diào)；而 MG63-miR-Scramble、MG63-miR-496-PM、MG63三個細胞株中，miR-496表達水平無變化，β-catenin表達水平也沒有明顯變化。說明miR-496表達增高后

7、，可以下調(diào)β-catenin表達；而miR-496點突變后，miR-496由于無法和β-catenin結(jié)合發(fā)生降解反應(yīng)，導(dǎo)致β-catenin的表達水平不發(fā)生變化，證實了miR-496能和β-catenin結(jié)合。
　?。?）miR-496高表達細胞株MG63-miR-496 mimics中侵襲細胞計數(shù)明顯低于其他三組（P＜0.01），MG63、MG63-miR-Scramble、MG63-miR-496-PM三組之間侵襲細胞計數(shù)無

8、顯著性差異（P＞0.05）。miR-496高表達能抑制β-catenin的表達，從而抑制骨肉瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：（1）生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)miRNA-496可能是β-catenin結(jié)合穩(wěn)定性最強，特異性最好的靶miRNA。
　　（2）骨肉瘤組織中miRNA-496和β-catenin表達具有負相關(guān)性。
　?。?）骨肉瘤細胞中miRNA-496和β-catenin表達具有負相關(guān)性，且與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。