HIPPO信號通路在小鼠原始卵泡啟動中的作用及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的:
　　闡明原始卵泡啟動的分子機(jī)制對于防治女性不孕癥和卵巢早衰具有重要意義。我們的前期研究表明HIPPO信號通路存在于小鼠卵巢，且與原始卵泡池大小具有時序相關(guān)性，然其具體作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本課題通過進(jìn)一步探究HIPPO信號通路在原始卵泡啟動過程中的表達(dá)、作用及其調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步了解原始卵泡啟動與靜息狀態(tài)維持的分子機(jī)制增添新資料。
　　方法:
　　1.建立小鼠原始卵泡體外培養(yǎng)模型，利用免疫熒光、Western

2、 blot檢測3 d小鼠卵巢體外培養(yǎng)8 d后HIPPO通路主要組分MST1、LATS2和YAP1的定位及表達(dá)變化。
　　2.構(gòu)建HIPPO信號通路主要效應(yīng)分子YAP1基因慢病毒載體：
　?。?）YAP1慢病毒過表達(dá)載體（Vector-YAP1）和陰性對照載體（Vector）。
　?。?）YAP1慢病毒干擾載體（shYAP1-1、shYAP1-2、shYAP1-3）和陰性對照載體(shControl)。
　　3.利

3、用免疫熒光和Western blot鑒定篩選YAP1沉默效果最強(qiáng)的慢病毒載體。
　　4. Vector-YAP1和shYAP1慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染3 d小鼠卵巢，HE染色和Western blot觀察上調(diào)/下調(diào)YAP1對小鼠原始卵泡啟動、生長的影響，同步檢測信號分子AKT表達(dá)變化。
　　5. AKT特異性抑制劑MK2206-2HCl添加于原始卵泡體外培養(yǎng)體系中，觀察AKT下調(diào)對原始卵泡啟動的影響，同步檢測HIPPO通路主要組分

4、如MST1、LATS2和YAP1的表達(dá)變化。
　　6.將YAP1高表達(dá)慢病毒載體加入MK2206-2HCl孵育的原始卵泡體外培養(yǎng)體系，觀察YAP1上調(diào)在AKT下調(diào)對原始卵泡啟動影響中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.免疫熒光結(jié)果顯示：HIPPO信號通路主要組分MST1、P-MST、LATS2、YAP1和P-YAP1在3 d和3 d培養(yǎng)8 d后小鼠卵巢中均有表達(dá)，且MST1與LATS2共表達(dá)于小鼠卵巢。在原始卵泡中，MST1

5、表達(dá)于卵母細(xì)胞質(zhì)；P-MST表達(dá)于卵母細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及顆粒細(xì)胞；LATS2表達(dá)于卵母細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核；YAP1和P-YAP1均表達(dá)于卵母細(xì)胞質(zhì)。在初級卵泡中，MST1表達(dá)于卵母細(xì)胞質(zhì)和顆粒細(xì)胞；P-MST表達(dá)于卵母細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及顆粒細(xì)胞；LATS2表達(dá)于卵母細(xì)胞質(zhì)和顆粒細(xì)胞；YAP1和P-YAP1均表達(dá)于卵母細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及顆粒細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示：3 d小鼠卵巢培養(yǎng)8 d后，MST1、P-MST、LATS2蛋白表達(dá)均

6、顯著減少（p<0.05，p<0.01，p<0.001）；YAP1、P-YAP1蛋白表達(dá)顯著增加（p<0.01，p<0.01）；P-MST/MST1、P-YAP1/YAP1比值顯著減少（p<0.05， p<0.05）。表明，隨著小鼠原始卵泡啟動HIPPO通路主要組分MST1、LATS2和YAP1表達(dá)量發(fā)生顯著變化，暗示原始卵泡啟動與HIPPO通路活性衰減密切相關(guān)。
　　2.構(gòu)建HIPPO信號通路主要效應(yīng)分子YAP1基因慢病毒載體。W

7、estern blot和免疫熒光檢測結(jié)果顯示：YAP1慢病毒過表達(dá)載體、干擾載體和陰性對照載體均可有效轉(zhuǎn)染小鼠卵巢組織。
　　3.篩選YAP1抑制效果最強(qiáng)的慢病毒載體：相對于Vector組，Vector-YAP1組YAP1蛋白表達(dá)水平顯著增加（p<0.05）；相對于shControl組，shYAP1-1、shYAP1-2、shYAP1-3組YAP1蛋白表達(dá)水平顯著減少（p<0.05，p<0.01，p<0.001），且以shYAP1

8、-3組抑制效果最為顯著，故選擇shYAP1-3組為最佳YAP1干擾組，記為shYAP1組。
　　4. Vector-YAP1和shYAP1慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染3 d小鼠卵巢。HE染色結(jié)果顯示：相較于Vector組，Vector-YAP1組原始卵泡數(shù)顯著減少（p<0.05），初級卵泡數(shù)顯著增加（p<0.05）；相較于shControl組，shYAP1組原始卵泡數(shù)增加（p>0.05），初級卵泡數(shù)顯著減少（p<0.05）。表明，HIPPO

9、通路主要效應(yīng)分子YAP1活性變化可顯著影響原始卵泡啟動過程。
　　5. Western blot結(jié)果顯示：YAP1過表達(dá)或抑制對AKT磷酸化水平無顯著影響（p>0.05）。AKT特異性抑制劑MK2206-2HCl添加于原始卵泡體外培養(yǎng)體系，相較于Control組，MK2206組AKT、MST1和YAP1總蛋白表達(dá)水平無顯著變化（p>0.05），而P-AKT/AKT和P-MST/MST1比值顯著減少（p<0.05，p<0.01），

10、P-YAP1/YAP1比值顯著增加（p<0.05）。表明，HIPPO通路位于AKT調(diào)控通路下游。
　　6. HE結(jié)果顯示：相較于Control組，MK2206組原始卵泡數(shù)顯著增加（p<0.01），初級卵泡數(shù)顯著減少（p<0.05）。在MK2206+Vector-YAP1組（將YAP1高表達(dá)慢病毒載體加入MK2206組）中，原始卵泡數(shù)目顯著高于Control組（p<0.05），但少于MK2206組（p<0.05）；初級卵泡數(shù)目顯著低