Mfn2-PERK在高遷移率族蛋白B1介導樹突狀細胞凋亡機制中的作用研究.pdf

1、膿毒癥是急危重癥醫(yī)學領域的重大難題，其中免疫細胞凋亡是膿毒癥免疫功能障礙的重要原因。而在機體免疫系統(tǒng)中，樹突細胞(dendritic cell，DC)作為人體最重要的抗原提呈細胞，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，其功能變化在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用不可替代，DC凋亡在膿毒癥免疫功能障礙發(fā)病機制中具有重要意義，與膿毒癥預后密切相關。高遷移率族蛋白B1(high mobilitygroup box-1 protein，HMGB1)是膿毒

2、癥重要的晚期炎癥介質，我們早期研究發(fā)現(xiàn)HMGB1體外刺激對DC免疫功能狀態(tài)具有雙向調節(jié)作用，但HMGB1介導DC凋亡效應及相關分子機制尚未明確。內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是真核細胞重要內源性保護機制，在一定程度上通過未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)對理化因素、病原體、細胞因子等刺激應激下細胞發(fā)揮保護作用，幫助細胞恢復正常功能。而ERS持續(xù)存在

3、或過強則啟動相關凋亡信號通路的活化誘導細胞凋亡的發(fā)生。我們前期研究結果表明，HMGB1作為炎癥介質，體外刺激可誘導DC發(fā)生明顯ERS，可能是HMGB1調控DC免疫功能的重要機制。ERS是否參與HMGB1介導DC凋亡效應尚不明確。內質網(wǎng)與線粒體功能結構上緊密相依，在細胞的生命活動中發(fā)揮重要作用。研究表明，定位于線粒體-內質網(wǎng)結構偶聯(lián)(mitochondria-endoplasmic reticulum physicalcoupling,o

4、r mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane(MAM))的多種分子通過影響內質網(wǎng)-線粒體之間的交互作用調節(jié)細胞功能。線粒體融合蛋白2(Mitofusin2，Mfn2)是目前定位在MAM上相關蛋白的研究熱點，與細胞的活化、凋亡等生理病理變化等存在重要聯(lián)系。更有研究報道Mfn2可與ERS三條關鍵信號通路的啟動子之一PERK形成直接物理連接，對PERK-eIF2α通路的激活起

5、著重要調控作用。本文采用分離培養(yǎng)的原代小鼠脾臟DC和小鼠DC細胞系(DC2.4)來探討Mfn2-PERK在HMGB1介導DC凋亡效應及相關機制中的作用及意義。
　　研究目的和方法:
　　1.分離培養(yǎng)正常BALB/c雄性小鼠脾臟DC，用不同濃度HMGB1(1，10，100ng/mL)刺激后培養(yǎng)24小時(h)，應用流式細胞術檢測DC凋亡，Western blotting檢測DC中ERS標志分子GRP78表達水平、PERK表達活化

6、水平及ERS介導細胞凋亡的關鍵分子CHOP表達水平。
　　2.進一步應用PERK抑制劑GSK2656157和Salubrinal(eIF-2α去磷酸化酶抑制劑)調控ERS相關通路關鍵分子的活性，探究其對HMGB1介導DC凋亡效應的影響。
　　3.穩(wěn)定培養(yǎng)可傳代的DC2.4細胞系，驗證HMGB1刺激的凋亡誘導效果及ERS反應情況;應用共聚焦顯微鏡檢測Mfn2在內質網(wǎng)上的定位。
　　4.應用Mfn2過表達慢病毒載體轉染DC

7、2.4，穩(wěn)定表達后再給予HMGB1刺激(10ng/mL,24h)，觀察細胞凋亡情況，應用流式細胞術檢測DC凋亡，Westernblotting法檢測培養(yǎng)細胞ERS相關因子GRP78、p-PERK/PERK和CHOP，以及Mfn2表達水平，探討Mfn2對PERK信號通路活化的調節(jié)作用以及對DC凋亡的影響。
　　結果:
　　1.HMGB1刺激后小鼠脾臟DC凋亡增加，HMGB1刺激48h后在不同劑量組小鼠脾臟DC凋亡率較24h時間

8、點有所增加(P＜0.05)，其中以HMGB1(10ng/ml)刺激組細胞凋亡率最高(P＜0.01)，但24h和48h差異并不明顯。應用HMGB1刺激后ERS相關蛋白GRP78、PERK、p-PERK和CHOP表達上調，其中GRP78表達隨劑量的增加而增加(P＜0.05)，而PERK、p-PERK和CHOP表達在10ng/ml刺激組最強(P＜0.01)。
　　2.Salubrinal干預可抑制HMGB1誘導的小鼠脾臟DC凋亡(P＜0

9、.05)，下調GRP78、PERK、p-PERK和CHOP表達水平;而應用PERK抑制劑GSK2656157干預可導致HMGB1作用下DC凋亡水平明顯增加(P＜0.01)。
　　3.HMGB1刺激DC2.4細胞株凋亡增加，與HMGB1介導DC凋亡效應相當，在10 ng/ml刺激24h作用明顯。同時伴隨PERK蛋白表達上調、活性增加(P＜0.05)，CHOP表達升高(P＜0.05)。
　　4.HMGB1刺激導致小鼠脾臟DC內M

10、fn2表達降低，且隨刺激劑量的增加而減少(P＜0.05)，HMGB1刺激下DC2.4細胞株的Mfn2蛋白表達亦明顯降低(P＜0.05)。
　　5.LV-Mfn2-GFP慢病毒轉染DC2.4細胞株可提高Mfn2表達水平，而細胞內PERK表達及活化水平均有所降低(P＜0.05)。同時HMGB1(10ng/ml)刺激下DC2.4細胞凋亡率明顯下降(P＜0.05); CHOP表達水平亦降低(P＜0.05)。
　　結論:
　　一