斑馬魚Rspo3基因的克隆、表達及初步功能研究.pdf

1、Wnt信號通路是生物體內(nèi)最重要的信號傳導途徑之一。Wnt和成體中控制細胞的增殖、分化以及形態(tài)發(fā)生。R-spondin(Rspo)是一個近年來新發(fā)現(xiàn)的蛋白家族,由4個分泌型蛋白組成(Rspo1-4)。研究報道Rspo蛋白在脊椎動物的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Rspo蛋白的作用與經(jīng)典Wnt信號通路的配體類似,都是通過激活β-catenin發(fā)揮其生物學活性。目前鮮有關(guān)于硬骨魚Rspo蛋白結(jié)構(gòu)與功能的報道。因此本研究克隆了斑馬魚Rspo3,并對其

2、結(jié)構(gòu)與功能進行了初步研究。
　　通過分析斑馬魚Rspo3的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),與現(xiàn)已報道的Rspo包含2個furin-like結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu)不同,斑馬魚Rspo3蛋白包含3個furin-like結(jié)構(gòu)域。為確定這種特殊的蛋白結(jié)構(gòu)是否在硬骨魚Rspo基因中普遍存在,本研究預(yù)測得到青鳉、河豚和三棘刺魚的Rspo3,并且發(fā)現(xiàn)這三種硬骨魚的Rspo3同樣具有3個furin-like結(jié)構(gòu)域。Rspo3 mRNA在斑馬魚早期胚胎發(fā)育的各個時期都有表

3、達。在12hpf(hours post fertilization)之前隨著胚胎的發(fā)育,Rspo3表達量逐漸升高;12hpf之后維持在相對穩(wěn)定的較高表達水平。原位雜交結(jié)果顯示Rspo3 mRNA在多個組織中表達,在神經(jīng)系統(tǒng)以及骨組織中表達水平較高。在斑馬魚胚胎中過表達Rspo3 mRNA導致胚胎嚴重畸形,包括頭部增大、軀干縮短、尾部卷曲等。過表達Rspo3導致的神經(jīng)胚層前部化、背部神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常以及抑制胚胎后部結(jié)構(gòu)的發(fā)育等表型類似于之

4、前報道的敲降了Wnt3a和/或Wnt8的胚胎表型,還與過表達了dkkl和Frzb的胚胎表型一致。將Rspo3 mRNA分別與Wnt3a、Writ8.1mRNA共注射后發(fā)現(xiàn),Rspo3的過表達可以挽救由Wnt3a或Wnt8.1過表達引起的A/P軸增長的表型,表明Rspo3可以抑制經(jīng)典Wnt信號通路。將Rspo3 mRNA與dkkl mRNA共注射,發(fā)現(xiàn)共注射Rspo3與dkkl可以促進dkkl過表達引起的背部化表型(頭部增大、A/P軸變短