肌細(xì)胞增強因子MEF2D在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和分子機制研究.pdf

1、全世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌都是最常見的惡性腫瘤之一，也是危及人類健康的重大疾病。近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐漸上升，結(jié)直腸癌的防治問題日益重要。結(jié)直腸癌有高轉(zhuǎn)移的腫瘤生物學(xué)特性，臨床上轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者占到腸癌總患者的40％以上，其預(yù)后極差，現(xiàn)有治療手段大多只能延長患者生存而無法治愈，所以結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移是其防治中的重點和難點。但關(guān)于腸癌轉(zhuǎn)移的機制認(rèn)識還很不足，沒有明確的轉(zhuǎn)移預(yù)測分子標(biāo)志，也沒有很好的治療靶點，所以研究結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移機制

2、有重大意義。
　　通常認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移步驟中重要的一環(huán)，但腸癌EMT的過程中有些問題目前認(rèn)識得還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。比如經(jīng)典的EMT轉(zhuǎn)錄因子在腸癌細(xì)胞中是如何被調(diào)控的，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生EMT的微環(huán)境信號又是通過哪些分子來激活癌細(xì)胞中的EMT關(guān)鍵基因的。對這些問題的探討有助于深入認(rèn)識腸癌EMT的機制，從而為轉(zhuǎn)移性腸癌的防治發(fā)現(xiàn)潛在的分子靶點。

3、>　　MEF2(Myocyte Enhancer Factor2)家族是具有多種生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子家族，其在胚胎發(fā)育，器官形成，肌肉，心血管和神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用已早被人們所認(rèn)識。近年來MEF2家族成員在腫瘤的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。我們課題組之前發(fā)現(xiàn)MEF2家族第4號成員即MEF2D在肝癌中異常高表達(dá)，其促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖并導(dǎo)致預(yù)后不良。后續(xù)有其他課題組報道了MEF2D在肺癌和骨肉瘤中的促癌作用，提示MEF2D可能是某些實體瘤中的潛在“癌基

4、因”，但MEF2D在結(jié)直腸癌中作用尚無報道，而且之前MEF2D在癌癥中的研究主要局限于其對癌細(xì)胞增殖的作用，MEF2D是否具有其他促腫瘤功能目前也不明確。
　　基于上述研究背景，我們在結(jié)直腸癌中展開了MEF2D促腫瘤功能的研究，致力于探討MEF2D對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其機制。
　　本課題的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.檢測臨床結(jié)直腸癌組織中MEF2D的表達(dá)情況，并探討MEF2D表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征和患者預(yù)

5、后的關(guān)系
　　以免疫組化的方法在93例臨床結(jié)直腸癌標(biāo)本中探討了MEF2D的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEF2D在結(jié)直腸癌組織中較相鄰癌旁組織和對應(yīng)正常腸粘膜組織有顯著異常的高表達(dá)，提示MEF2D可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著某些作用。
　　通過比較不同臨床病理特征的患者腫瘤中MEF2D表達(dá)的差異，我們發(fā)現(xiàn)MEF2D的異常高表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)具有正相關(guān)性，而與患者的生存時間呈負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果初步提示了MEF2

6、D可能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致不良預(yù)后。
　　2.在細(xì)胞實驗和動物腫瘤模型中研究了MEF2D對腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　在高侵襲且間質(zhì)樣的癌細(xì)胞與低侵襲且上皮樣的癌細(xì)胞之間比較MEF2D的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)MEF2D表達(dá)量與細(xì)胞的侵襲能力正相關(guān)，而與上皮樣標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)。通過敲低MEF2D和過表達(dá)MEF2D，我們證明了MEF2D具有促進(jìn)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲轉(zhuǎn)移的功能，并在動物實驗中驗證了MEF2D對腸癌細(xì)胞

7、在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的重要作用。
　　3.研究MEF2D對腸癌細(xì)胞EMT表型的影響
　　通過在MEF2D高表達(dá)的間質(zhì)樣腸癌細(xì)胞中敲低其表達(dá)，同時在低MEF2D表達(dá)的上皮樣腸癌細(xì)胞中過表達(dá)MEF2D，我們發(fā)現(xiàn)MEF2D對腫瘤細(xì)胞的EMT表型確有調(diào)控作用:它在間質(zhì)樣細(xì)胞中維持其間質(zhì)樣表型，并促進(jìn)上皮樣細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　4.發(fā)現(xiàn)MEF2D調(diào)控EMT的關(guān)鍵分子ZEB1，并探討其調(diào)控的具體分子機制
　　通過敲低MEF2D觀察

8、其對部分EMT關(guān)鍵分子表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)均明顯下降。通過MEF2D過表達(dá)實驗，免疫熒光，流式細(xì)胞術(shù)等進(jìn)一步檢測MEF2D與ZEB1的表達(dá)的關(guān)系，證明了EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一的ZEB1的表達(dá)受到MEF2D的調(diào)控。
　　通過染色質(zhì)免疫沉淀，啟動子報告基因檢測等方法實驗證明了ZEB1是MEF2D直接靶基因。另外我們發(fā)現(xiàn)敲低MEF2D后ZEB1啟動子組蛋白乙酰化水平減低，組蛋白乙?；竝300在ZEB1啟動子上的

9、結(jié)合下降。
　　5.在微環(huán)境EMT誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)下觀察MEF2D的表達(dá)及其功能
　　以常用的腸癌細(xì)胞EMT誘導(dǎo)因子如EGF和缺氧，構(gòu)建腸癌細(xì)胞的EMT模型，并觀察其中MEF2D的變化。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEF2D在多種微環(huán)境EMT誘導(dǎo)信號刺激下表達(dá)都明顯且迅速地上調(diào)，敲低MEF2D后部分因子誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT過程受到明顯的阻礙。
　　6.探討MEF2D在微環(huán)境EMT誘導(dǎo)因子激活ZEB1表達(dá)中的作用
　　通過觀察MEF2D

10、和ZEB1在胞外EMT信號刺激下表達(dá)的動態(tài)變化，我們推測MEF2D的表達(dá)上調(diào)可能是ZEB1表達(dá)激活的前提。在MEF2D穩(wěn)定敲低的細(xì)胞中以多種EMT誘導(dǎo)因子來刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其ZEB1的表達(dá)激活被阻斷。并且我們在實驗小鼠轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本中觀察到，在MEF2D敲低細(xì)胞接種產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移腫瘤中ZEB1的表達(dá)不能檢出。
　　綜上所述，本研究得出的主要結(jié)論有:
　　1.MEF2D在人類結(jié)直腸癌中異常高表達(dá)且與轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān);
　　2.M