EGFR基因19外顯子缺失突變檢測方法的研究.pdf

1、目的：利用 PCR、酶切及藍白斑篩選技術，通過野生型、突變型質粒混合模擬不同比例檢測EGFR基因19外顯子缺失突變，建立一種快速、靈敏、廉價的 EGFR基因診斷技術。
　　方法：根據(jù)EGFR基因19外顯子del E746-A750和del L747–S752 ins S缺失突變，即15堿基和18堿基缺失突變?yōu)闄z測靶點，分別設計相關配對引物，構建野生型及突變型質粒模版；設計一組特異性PCR引物，并以EGFR野生型、突變型質粒為模板模

2、擬實際標本中野生型與突變型基因比例，進行插入片段的 PCR擴增；結合藍白斑篩選技術原理，野生型閱讀框架中因含有終止密碼子 TAA，菌落呈白色，缺失突變型因丟失特定的一段核酸片段而不含有終止密碼子 TAA，故菌落呈現(xiàn)藍色，以此確定樣品有無EGFR基因19外顯子的缺失突變；通過限制性內切酶酶切野生型片段，可以減少白色菌落克隆數(shù)量，間接富集突變型DNA，提高檢測效率。
　　結果：EGFR基因野生型插入片段分子克隆的菌落為白色，突變型插入