棉花耐鹽基因GhNHX1啟動(dòng)子的克隆及功能分析.pdf

1、目前在植物基因工程中廣泛應(yīng)用啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子不能從時(shí)間和空間上有效的調(diào)控目的基因的表達(dá)。不加控制的、大量表達(dá)外源基因可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物造成毒害，也會(huì)在能源利用上造成浪費(fèi)。所以對(duì)于誘導(dǎo)型、組織特異型的啟動(dòng)子的研究和利用就顯的尤為重要。鹽脅迫是影響植物產(chǎn)量的重要因素之一，目前關(guān)于鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子的功能分析很少。 液泡型Na<'+>/H<'+>逆向運(yùn)轉(zhuǎn)體(NHXl)是近年來(lái)分離

2、到的在植物耐鹽性中起著重要作用的一類功能蛋白。液泡型Na<'+>/H<'+>逆向運(yùn)轉(zhuǎn)體蛋白體利用將液泡基質(zhì)中質(zhì)子順電化學(xué)梯度運(yùn)出液泡，同時(shí)將胞質(zhì)中的Na<'+>逆濃度梯度運(yùn)入液泡內(nèi)積累，這不僅能夠降低胞質(zhì)內(nèi)的Na<'+>以維持胞質(zhì)正常的K<'+>/Na<'+>比值，還可以有效利用儲(chǔ)存在液泡中的Na<'+>作為滲透調(diào)節(jié)劑。 從棉花中克隆的液泡型Na<'+>/H<'+>逆向運(yùn)轉(zhuǎn)體基因GhNHX1，能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草和水稻的耐鹽性。以

3、此為基礎(chǔ)，本研究利用TAIL-PPCR方法克隆了GhNHX1的啟動(dòng)子，并通過(guò)PCR方法獲得一系列5’端缺失片斷，將啟動(dòng)子及5’端缺失片斷與報(bào)告基因GUS融合，轉(zhuǎn)化煙草懸浮細(xì)胞，利用0.1M NaCl處理轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子能響應(yīng)鹽脅迫的誘導(dǎo)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)一段響應(yīng)NaCl脅迫信號(hào)誘導(dǎo)較強(qiáng)的區(qū)域。主要研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)GhNHX1基因5’非編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，利用TAIL-PCR的方法，從棉花基因組中克隆了長(zhǎng)度為1610bp的

4、DNA片斷。該DNA片斷有49個(gè)堿基和GhNHX1基因5’非編碼區(qū)重疊，認(rèn)為包含GhNHX1的啟動(dòng)子?；蜚y行注冊(cè)號(hào)EF650649。利用PlantCARE和PLACE兩個(gè)啟動(dòng)子順式元件分析網(wǎng)站分析啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-22/-16區(qū)存在一個(gè)TATA-box(ATATAAT)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了鹽誘導(dǎo)元件G3T1GMSCAM4元件(GAAAAA)和一些冷、干旱脅迫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件，如MYB識(shí)別位點(diǎn)(AACG,WAACCA)、M

5、YC識(shí)別位點(diǎn)(CANNTG)。預(yù)測(cè)的結(jié)果表明克隆到的該DNA片斷具有典型啟動(dòng)子的一般特征，并且可能與各種脅迫誘導(dǎo)有關(guān)。 2．將GhNHX1啟動(dòng)子(-1561/+49)構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體pBI121載體，替換掉35S啟動(dòng)子，與報(bào)告基因GUS融合，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草懸浮細(xì)胞。同時(shí)，利用PCR的方法對(duì)GhNHX1，啟動(dòng)子(-1561/+49)進(jìn)行5’端缺失，將5’端缺失片斷同樣構(gòu)建到pBI121載體，轉(zhuǎn)化煙草懸浮細(xì)胞

6、。將所有的轉(zhuǎn)化體通過(guò)測(cè)定GUS活性來(lái)表示啟動(dòng)子的活性。GUS活性測(cè)定結(jié)果表明GhNHX1啟動(dòng)子是一個(gè)鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，響應(yīng)鹽脅迫信號(hào)最強(qiáng)的是-52/+49區(qū)域，最強(qiáng)誘導(dǎo)比值達(dá)3.72，誘導(dǎo)后的表達(dá)量超過(guò)了35S的表達(dá)量。 3．GhNHXl啟動(dòng)子-52/-25區(qū)段連接在pBI121載體35S△46(35S啟動(dòng)子3’端46堿基，基本啟動(dòng)子)，與報(bào)告基因GUS融合。GUS活性測(cè)定結(jié)果表明，該區(qū)段能夠響應(yīng)鹽脅迫的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)比值2.55。

7、 4．將GhNHXl啟動(dòng)子-52/-25區(qū)段標(biāo)記放射性同位素<'32>P，與核蛋白結(jié)合，進(jìn)行凝膠遷移滯留試驗(yàn)(EMSA)，即進(jìn)行聚丙稀酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后放射自顯影。結(jié)果表明，-52/-25區(qū)段能夠和核蛋白特異結(jié)合，進(jìn)一步說(shuō)明該DNA區(qū)段可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。 5．GhNHXl啟動(dòng)子-183/+49區(qū)段構(gòu)建到pBI121載體，替換35S啟動(dòng)子，與報(bào)告基因GUS融合，轉(zhuǎn)化煙草愈傷，培養(yǎng)成苗，然后進(jìn)行GUS染色，分析Gh