異牛肝菌素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：近年來(lái)，隨著環(huán)境污染和人口老齡化等因素，全球癌癥患者和死亡病例不斷增加，并呈逐年迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。在所有的癌癥中，肺癌仍是最普遍和最致命的惡性腫瘤，每年全球肺癌新增病例約180萬(wàn)，占全球所有癌癥新增病例的13％；每年約有160萬(wàn)人死于肺癌，占全球癌癥死亡病例的20%；肺癌患者的5年生存率不到15%。在中國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率一直居于首位，約占全世界肺癌病例的1/3以上。目前，臨床上對(duì)癌癥的治療效果依然處在相對(duì)較低的水平，常用化療藥物的

2、效能因其一系列的副反應(yīng)而受限，因此，尋找或合成更為安全有效的抗腫瘤藥物依然是擺在醫(yī)藥工作者面前的迫切任務(wù)。在很久以前真菌就有作為藥物的記載。有很多真菌類的代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤、抗氧化、抗感染和消炎止痛等作用。一些研究資料表明，天然植物和真菌類含有豐富的酚類化合物，其中部分化合物表現(xiàn)出了很高的生物活性。異牛肝菌素（iso-suillin）屬于異戊二烯基酚類化合物，從乳牛肝菌（Suillus flavus）中分離得到。通過(guò)篩選和研究發(fā)

3、現(xiàn)，iso-suillin表現(xiàn)出了較強(qiáng)的生物活性，能夠在體外有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡；與順鉑（CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）比較，iso-suillin表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抑瘤作用，并且對(duì)正常人的淋巴細(xì)胞沒(méi)有毒性。在以前研究的基礎(chǔ)上，本研究致力于通過(guò)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)和裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探討iso-suillin的抗腫瘤作用及機(jī)制。
　　方法：⑴細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞以RPMI1640培養(yǎng)基，

4、含10% FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑵MTS法檢測(cè)不同濃度iso-suillin處理后A549細(xì)胞體外增殖活性并繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。⑶流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率收集細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS洗1次，離心棄上清，分別用1×Banding buffer重懸細(xì)胞，使其終濃度為1×106 cells/mL，取100 uL，加入5μL Annexin V-FITC和1

5、0μL PI solution，室溫下避光染色15 min，Epics-XLII流式細(xì)胞儀檢測(cè)，繪制直方圖并計(jì)算出G0/G1、S、G2/M期分布百分比及早期和晚期凋亡率。⑷Iso-suillin對(duì)裸鼠的藥物毒性實(shí)驗(yàn)選取6只6～8周齡雌性裸鼠，皮下注射給藥，持續(xù)2周觀察裸鼠生活狀態(tài)及體重情況。⑸Iso-suillin抑制裸鼠移植瘤增殖實(shí)驗(yàn)挑選腫瘤大小為90～110 mm3的裸鼠，隨機(jī)分成兩組，分別用生理鹽水和iso-suillin稀釋液瘤

6、旁皮下注射給藥，隔天注射一次，觀察兩周，記錄小鼠體重和腫瘤大小。腫瘤體積按照以下公式來(lái)計(jì)算：腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2。⑹移植瘤組織包埋、切片及H&E染色裸鼠腫瘤組織塊取出后放入10%中性甲醛中固定48 h以上，取出后將腫瘤組織切成約3 mm厚度，常規(guī)包埋和切片，H&E染色，封片后鏡下觀察拍照。⑺移植瘤組織切片TUNEL法檢測(cè)凋亡組織切片脫蠟后參照TUNEL法操作步驟進(jìn)行染色后熒光顯微鏡下觀察拍照。⑻細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)

7、胞以1×105 cells/mL濃度接種于24孔板中，用不同濃度的iso-suillin處理24 h，PBS洗一遍后用倒置相差顯微鏡觀察拍照；然后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，用1%TritonX-100透膜5 min，加入DAPI（5μg/mL）染色，熒光顯微鏡下記錄其細(xì)胞核形態(tài)。⑼線粒體膜電位檢測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以不同濃度的iso-suillin處理后進(jìn)行JC-1染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。⑽蛋白質(zhì)免疫印記（West

8、ern Blot）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度的iso-suillin處理后提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)蛋白定量后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)DNA損傷，細(xì)胞周期和凋亡及p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。⑾統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析（One-Way ANOVA），取P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：①A549細(xì)胞的增殖活性隨著iso-suillin濃度的增高和給

9、藥時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。不同濃度iso-suillin處理A549細(xì)胞6、12、24、48和72 h后，其半數(shù)抑制濃度IC50值分別為80.86、39.40、11.56、1.43和0.43μM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，iso-suillin對(duì)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且具有濃度和時(shí)間依賴性。②經(jīng)過(guò)不同濃度iso-suillin皮下注射后未發(fā)現(xiàn)裸鼠的異常情況，裸鼠的飲食與體重增加情況與空白組比較沒(méi)有明顯差異。A549細(xì)胞裸鼠移植瘤成瘤率

10、為100%，接種后第14 d，移植瘤體積生長(zhǎng)至約100 mm3。第1、5、9、13和17 d，對(duì)照組的裸鼠體重（ g）分別為16.98±0.35、17.13±0.30、17.16±0.54、18.29±0.55和19.18±1.21；對(duì)照組移植瘤體積（mm3）分別為89.38±15.30、125.68±8.83、220.38±48.63、311.16±93.67和600.91±133.03；實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重分別為17.12±0.36、17

11、.13±0.38、17.58±0.61、18.46±1.15和19.62±0.83，實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積分別為93.06±17.79、128.89±12.97、205.70±34.75、310.57±87.93和383.36±107.11。在第17 d，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，裸鼠體重之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），移植瘤體積之間具有顯著性差異（P＜0.05）。③A549細(xì)胞經(jīng)0、3.12、6.25和12.5μM iso-suillin處理2

12、4 h后，G0/G1期細(xì)胞比例為44.8±2.17％、58.5±1.98％、59.3±1.76％、55.1±2.62％；S期細(xì)胞分別為46.9±2.23％、28.1±1.74％、27.8±3.02％、31.7±2.38％；G2/M期細(xì)胞分別為8.3±3.12％、13.4±2.56％、15.9±2.48％、13.2±1.56％。即隨著處理藥物濃度的增加G0/G1期細(xì)胞所占比例增加(P<0.05)。A549細(xì)胞早期凋亡比例為3.16±0.0

13、812%、9.71±1.25%、40.88±5.26%和39.35±4.56%，晚期凋亡比例為0.65±0.09%、3.07±1.32%、14.83±1.25%和18.43±2.35%，藥物處理組早期凋亡較對(duì)照組升高，具有明顯差異（P<0.05）；晚期凋亡較對(duì)照組升高明顯，具有濃度依賴性（P<0.05）。④不同濃度iso-suillin處理A549細(xì)胞24 h后，分別通過(guò)倒置相差顯微鏡在可見(jiàn)光下觀察和利用DAPI染色后在倒置熒光顯微鏡下

14、觀察細(xì)胞的變化及凋亡的形態(tài)特征。在可見(jiàn)光下觀察對(duì)照組細(xì)胞較多，貼壁牢固，個(gè)體狀態(tài)飽滿，細(xì)胞膜完整，呈梭形或多邊形，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞開(kāi)始脫離底壁，縮成圓形，細(xì)胞膜出泡，細(xì)胞裂解成很多凋亡小體分散開(kāi)來(lái)；在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組的細(xì)胞核界限清晰，呈圓形或者橢圓形，細(xì)胞核內(nèi)部藍(lán)色熒光均勻分布，偶可見(jiàn)分裂像的細(xì)胞核，而iso-suillin處理后的部分A549細(xì)胞，核開(kāi)始縮小，染色質(zhì)分布不均勻，呈現(xiàn)凝集，核碎裂形成許多球形顆粒。⑤

15、裸鼠移植瘤經(jīng)過(guò)常規(guī)H&E染色后，在顯微鏡下進(jìn)行觀察的結(jié)果：對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，著色均勻，部分呈現(xiàn)分裂像，偶可見(jiàn)著色較深的染色體，細(xì)胞分裂旺盛；處理組移植瘤組織切片中的細(xì)胞胞漿濃縮，核固縮，著色較深，細(xì)胞膜不完整，可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞壞死。組織切片經(jīng)過(guò)TUNEL染色后再由DAPI復(fù)染，放置在熒光顯微鏡下觀察，在相同的曝光時(shí)間下，對(duì)照組細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，DNA均勻完整，TUNEL染色后代表DNA斷裂的綠色熒光亮度非常微弱，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)

16、胞出現(xiàn)核固縮， DNA呈彌散狀態(tài)，TUNEL染色后細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光很強(qiáng)，說(shuō)明藥物處理后移植瘤內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)大面積的細(xì)胞DNA斷裂，表明iso-suillin能夠阻礙移植瘤內(nèi)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)裸鼠移植瘤細(xì)胞壞死或凋亡。⑥iso-suillin處理A549細(xì)胞后，利用JC-1染色后在熒光顯微鏡下觀察，通過(guò)分析綠色和紅色熒光強(qiáng)度的比值來(lái)反應(yīng)線粒體膜電位變化，結(jié)果顯示，線粒體膜電位的降低與藥物濃度呈量效關(guān)系，線粒體膜電位隨藥物濃度升高而降低。⑦A549

17、細(xì)胞經(jīng)不同濃度iso-suillin處理后， Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如下：與β-actin蛋白比較，caspase-8蛋白的IOD比值分別為：0.17±0.04、0.21±0.04、0.30±0.05和0.45±0.07；caspase-9蛋白的IOD比值分別為0.14±0.03、0.37±0.05、0.41±0.07和0.64±0.06；pro-caspase-3蛋白的IOD比值分別為0.48±0.06、

18、0.46±0.08、0.44±0.05和0.38±0.06；cleaved caspase-3蛋白的IOD比值分別為0.02±0.01、0.03±0.01、0.08±0.02和0.15±0.04；Bax蛋白的IOD比值分別為：0.43±0.05、0.57±0.03、1.56±0.04和2.83±0.14；Bcl-2蛋白的 IOD比值分別為：0.16±0.03、0.14±0.04、0.09±0.02和0.07±0.02；p27蛋白的IOD

19、比值分別為0.13±0.04、0.42±0.09、0.87±0.12和0.93±0.10；cyclin D1蛋白的 IOD比值分別為1.42±0.11、0.87±0.09、0.43±0.04和0.08±0.03；CDK4蛋白的 IOD比值分別為0.43±0.05、0.37±0.06、0.38±0.07和0.29±0.06；E2F-1蛋白的IOD比值分別為0.27±0.04、0.24±0.03、0.04±0.02和0.02±0.02；γ-

20、H2AX蛋白的IOD比值分別為0.04±0.02、0.08±0.03、0.25±0.04和0.56±0.09；p53（phospho S20）蛋白的IOD比值分別為0.02±0.01、0.03±0.01、0.09±0.04和0.20±0.08；p53（phospho S15）蛋白的IOD比值分別為0.04±0.02、0.09±0.04、0.16±0.05和0.34±0.09；野生型p53蛋白的IOD比值分別為0.48±0.07、0.35

21、±0.08、0.12±0.04和0.03±0.01。結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng) iso-suillin處理后的A549細(xì)胞中cleaved caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、p27、γ-H2AX、p53（phospho S20）、p53（phospho S15）蛋白表達(dá)量增高，具有顯著性差異（P<0.05）；Bcl-2、E2F-1、p53、cyclinD1蛋白表達(dá)量降低，具有顯著性差異性（P<0.0

22、5）；pro-caspase3和CDK4蛋白表達(dá)量略微下降，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：⑴Iso-suillin能夠在體外抑制A549細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。⑵Iso-suillin能夠抑制A549細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死，而對(duì)裸鼠沒(méi)有明顯藥物毒性。⑶Iso-suillin能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。⑷Iso-suillin能夠?qū)е翧549細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷。⑸Iso-suillin可以通