SFRP5沉默對(duì)人膽管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究目的：探討使用慢病毒介導(dǎo)短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA。shRNA）沉默SFRP5（secreted frizzled-related proteins-5。SFRP5）基因?qū)θ祟?lèi)膽管癌RBE細(xì)胞株增殖、遷移以及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究方法：對(duì)人膽管癌RBE細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)，制備設(shè)計(jì)SFRP5干擾片段，使用慢病毒載體pLVX-shRNA2構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒，并進(jìn)行基因測(cè)序鑒定，將構(gòu)建好的慢病毒s

2、hRNA載體以及輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得重組慢病毒,利用梯度測(cè)定法測(cè)定慢病毒滴度，使用FuGENE? HD轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒轉(zhuǎn)染入RBE細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RBE細(xì)胞株，利用 Western blot印跡法檢測(cè)SFRP5-siRNA干擾組以及對(duì)照組的SFRP5蛋白表達(dá)水平變化，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè) SFRP5在 RBE細(xì)胞中的表達(dá)情況，利用 Real-time PCR檢測(cè)SFRP5-siRNA干擾組以及對(duì)照組mRNA表達(dá)水平

3、的變化，通過(guò)Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究SFRP5沉默對(duì)膽管癌細(xì)胞的遷移能力的變化，使用CCK-8法檢測(cè)SFRP5低表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖水平的影響，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SFRP5低表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示RBE細(xì)胞株呈SFRP5陽(yáng)性，故使用RBE細(xì)胞實(shí)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將慢病毒RNA干擾慢病毒載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞后，在熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)

4、轉(zhuǎn)染成功的293T細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，慢病毒濃縮后測(cè)得滴度為1×109 TU/ml，測(cè)序結(jié)果呈陽(yáng)性；重組慢病毒成功轉(zhuǎn)染RBE細(xì)胞，48h后通過(guò)熒光倒置顯微鏡可見(jiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率約達(dá)90％；Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組對(duì)比，SFRP5-siRNA干擾組組蛋白表達(dá)明顯抑制，同時(shí)RT-PCR結(jié)果顯示。SFRP5-siRNA干擾組細(xì)胞株SFRP5基因mRNA表達(dá)水平明顯降低（p=0.0087），證實(shí)重組SFRP5慢病毒載體能夠有效

5、抑制RBE細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)水平；CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組對(duì)比。SFRP5-siRNA干擾組增殖活性明顯增加（p<0.05）；同時(shí)Transwell法檢測(cè)結(jié)果顯示。SFRP5-shRNA-RBE組的穿膜細(xì)胞數(shù)約為[（310±15.63）個(gè)]，較NC-shRNA-RBE組的穿膜細(xì)胞數(shù)[（75±8.6）個(gè)]明顯增加（p<0.05）；同時(shí)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示劃痕后的12h及24h時(shí)，SFRP5-siRNA干擾組細(xì)胞遷移率顯著大于

6、對(duì)照組（p<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，SFRP5-siRNA干擾組細(xì)胞凋亡率（2.3%）明顯低于對(duì)照組（12.3%），且處于G1期的SFRP5-siRNA干擾組細(xì)胞多于對(duì)照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：SFRP5可能在肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)節(jié)作用，SFRP5低表達(dá)激活wnt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文得出以下結(jié)論：人肝內(nèi)膽管癌RBE細(xì)胞株中，沉默SFRP5基因表達(dá)可顯著增強(qiáng)RBE細(xì)胞