中國青島文昌魚死亡受體及接頭分子的進(jìn)化與功能研究.pdf

1、本論文通過分子克隆手段得到中國青島文昌魚的3個(gè)死亡受體基因(分別命名為91614，91616和91618)。序列分析顯示，文昌魚3個(gè)死亡受體胞外識別配體的區(qū)域和TRAIL受體OPG(TNFR家族成員之一)的同源性最高，我們預(yù)測這3個(gè)死亡受體可能是TRAIL識別受體的祖先分子。系統(tǒng)進(jìn)化分析推測文昌魚死亡受體的產(chǎn)生源于一次TNFR胞外區(qū)與FADD死亡結(jié)構(gòu)域的重組事件。成體原位雜交實(shí)驗(yàn)證明文昌魚3個(gè)死亡受體主要在消化道、肝盲囊、性腺和皮膚等免

2、疫相關(guān)的組織進(jìn)行表達(dá)，在LPS刺激后表達(dá)有小幅上調(diào)，印證了這類凋亡相關(guān)的受體分子可能參與文昌魚的免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄本研究表明91616和91618具有多種剪接體，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明文昌魚死亡受體能夠準(zhǔn)確定位于HEK293T和Hela細(xì)胞的細(xì)胞膜上，而缺失了信號肽或者胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域的剪接體則不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定位。進(jìn)一步的功能研究表明過表達(dá)文昌魚的死亡受體能夠依賴其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域引發(fā)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，但該類基因的過表達(dá)并不激活NF—κB、A

3、P-1等核轉(zhuǎn)錄因子，這說明在文昌魚中出現(xiàn)的死亡受體不僅僅具有完整的結(jié)構(gòu)，而且已經(jīng)能夠發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，同時(shí)不同剪接體可能提供了完善的調(diào)控機(jī)制。 本論文還克隆得到凋亡信號通路中另一個(gè)關(guān)鍵的接頭分子并命名為BbtCRADD，且對該分子及本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到的BbtFADD1和BbtFADD2分子進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞定位分析和初步的功能驗(yàn)證。結(jié)果顯示BbtFADD1和BbtCRADD主要在細(xì)胞質(zhì)中形成絲狀結(jié)構(gòu)，而BbtFADD2在細(xì)胞核

4、內(nèi)呈點(diǎn)狀或絲狀分布。和哺乳動(dòng)物FADD和CRADD的細(xì)胞定位進(jìn)行比較分析，表明文昌魚的這類分子可能已經(jīng)具備了寡聚化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，提示我們經(jīng)由FADD和CRADD募集caspase誘導(dǎo)凋亡的信號通路在文昌魚中已經(jīng)形成。然而，意外的是我們發(fā)現(xiàn)這三個(gè)分子在Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞中過表達(dá)均不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，相反，BbtFADD1能有效地激活NF—κB這條抗凋亡的信號通路。這提示我們雖然FADD分子保守地在果蠅直到脊椎動(dòng)物中存在，但在

5、不同的進(jìn)化階段，它們所發(fā)揮的功能不盡相同。而文昌魚三個(gè)死亡受體是否可以募集這類分子進(jìn)行下游的信號傳遞還有待進(jìn)一步的研究。 總的來說，本論文的發(fā)現(xiàn)重新定義了TRAIL受體的出現(xiàn)始于文昌魚，其首次出現(xiàn)即經(jīng)歷了倍增。不僅如此，這類原始的基因還存在著復(fù)雜的多剪接體形式，這表明該類基因在脊椎動(dòng)物祖先中已經(jīng)出現(xiàn)并具備了可調(diào)節(jié)的、誘導(dǎo)凋亡的功能。多剪接體的形式暗示了其功能的復(fù)雜性和新穎性，同時(shí)多接頭分子的存在和功能的分化也表明一個(gè)初具雛形的死