端粒復(fù)合體在早發(fā)冠心病患者中作用機(jī)制研究.pdf

1、多項(xiàng)研究提示冠心病患者較正常對(duì)照外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度縮短。端粒復(fù)合體，包括端粒DNA、端粒相關(guān)蛋白、端粒酶，其中端粒相關(guān)蛋白對(duì)于端粒DNA起保護(hù)作用。TRF1、TRF2、POT1直接和端粒DNA結(jié)合，可能對(duì)于端粒長(zhǎng)度的變化起到更關(guān)鍵作用。
　　目的:
　　(1)探究早發(fā)冠心病患者及冠造陰性人群外周血白細(xì)胞中TRF1、TRF2、POT1蛋白表達(dá)水平及端粒長(zhǎng)度的差異，及與臨床特點(diǎn)的關(guān)系。
　　(2)探究早發(fā)冠心病患者及冠造

2、陰性組外周血單個(gè)核細(xì)胞及粒細(xì)胞兩種不同細(xì)胞的端粒相關(guān)蛋白的表達(dá)水平及端粒長(zhǎng)度差異，探究早發(fā)冠心病的外周血白細(xì)胞的特點(diǎn)。
　　(3)培養(yǎng)早發(fā)冠心病患者單核巨噬細(xì)胞，初步探究危險(xiǎn)因素作用前后其端粒長(zhǎng)度及端粒相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。
　　方法:
　　(1)第一部分納入52例PCAD患者及42例冠造陰性對(duì)照，所有患者均在北京協(xié)和醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈造影明確診斷，造影前留取動(dòng)脈全血提取DNA及RNA，測(cè)定外周血白細(xì)胞端粒DNA長(zhǎng)度和三種端

3、粒相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　(2)第二部分納入36例PCAD患者及10例冠造陰性對(duì)照，取動(dòng)脈全血，通過(guò)密度梯度離心法分離外周血PBMC細(xì)胞，剩余細(xì)胞裂解紅細(xì)胞后獲取粒細(xì)胞，從中提取DNA及RNA，分別測(cè)定這兩種細(xì)胞端粒DNA長(zhǎng)度和端粒相關(guān)蛋白的表達(dá)水平差異。
　　(3)第三部分納入6例PCAD患者及3例冠造陰性對(duì)照，取動(dòng)脈全血，通過(guò)密度梯度離心法分離外周血PBMC細(xì)胞，培養(yǎng)后經(jīng)貼壁的方法分離單核細(xì)胞，PMA刺激48小時(shí)誘導(dǎo)細(xì)

4、胞巨噬化，用空白培養(yǎng)基、50 ug/ml ox-LDL+10-3mol/L尼古丁、10 ug/ml oxLDL、50 ug/ml ox-LDL、10-6mol/L尼古丁、10-3mol/L尼古丁六種不同處理，收獲24小時(shí)、72小時(shí)細(xì)胞，測(cè)定端粒DNA長(zhǎng)度和三種端粒相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1)第一部分結(jié)果說(shuō)明PCAD患者較冠造陰性這端粒長(zhǎng)度更短（5.19±0.53KB vs6.24±2.54 KB），具有顯著性

5、差異(P=0.011)。研究還發(fā)現(xiàn)，PCAD組患者TRF1表達(dá)量較冠造陰性組更低（0.03±0.88 vs0.44±0.78，P=0.024），POT1表達(dá)量更高（-0.64±0.84 vs-1.27±0.91，P=0.001），差異均具有顯著性;兩組TRF2表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異。POT1的表達(dá)量和年齡呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，POT1表達(dá)量=-0.024×年齡+0.280(r2=0.047，P=0.044)。TRF1、TRF2、POT1表達(dá)量間具有

6、顯著相關(guān)性，除此之外，TRF1表達(dá)量還與高脂血癥顯著負(fù)相關(guān)(P=0.022)，POT1與白細(xì)胞中性粒細(xì)胞比例顯著正相關(guān)(P=0.003)。
　　(2)第二部分結(jié)果說(shuō)明全體入選者中，粒細(xì)胞比PBMC細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度DNA相對(duì)更短(差值為(-0.67±2.14) KB，P=0.041)，TRF1、TRF2、POT1的表達(dá)量相對(duì)更高，粒細(xì)胞和PBMC細(xì)胞的差值和P值分別為0.55±1.05，P=0.002;0.74±0.90，P=0.00

7、0;0.98±1.09，P=0.000。粒細(xì)胞及PBMC細(xì)胞的各種端粒相關(guān)蛋白的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)性（P值分別為0.011，0.002，0.000），兩種細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度相關(guān)性則不顯著。冠造陰性組中，粒細(xì)胞比PBMC細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度顯著更短，差值為(-1.43±1.28) KB;P=0.010;而在PCAD人群中，兩者的端粒長(zhǎng)度沒(méi)有明顯差異。
　　(3)第三部分結(jié)果顯示人外周血單核巨噬細(xì)胞在不同危險(xiǎn)因素刺激下培養(yǎng)72小時(shí)端粒未見(jiàn)明顯

8、改變(P=0.226);在受到不同刺激時(shí)，PCAD組TRF2、POT1表達(dá)較冠造陰性組顯著增加（差值和P值分別為0.002，0.000），TRF1則無(wú)顯著差異(P=0.133);不同培養(yǎng)時(shí)間TRF1、TRF2、POT1表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P值分別為0.126，0.730，0.389);在冠造陰性組當(dāng)中，10 ug/mloxLDL及10-6mol/L尼古丁有抑制TRF1、TRF2、POT1表達(dá)的趨勢(shì)，而50 ug/ml oxLDL、10-

9、3mol/L尼古丁有促進(jìn)TRF1、TRF2、POT1表達(dá)的趨勢(shì);PCAD組中情況類(lèi)似，10 ug/mloxLDL有促進(jìn)TRF2表達(dá)趨勢(shì);10-6mol/L尼古丁有促進(jìn)POT1表達(dá)趨勢(shì);50 ug/ml oxLDL、10-3mol/L尼古丁及兩者混合的作用差異不顯著。
　　結(jié)論:
　　(1)TRF1表達(dá)水平降低、POT1表達(dá)水平增高與PCAD的疾病進(jìn)程有一定相關(guān)性;POT1可能是衰老的潛在生物學(xué)標(biāo)記物;高脂血癥可能通過(guò)降低TR

10、F1水平誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程，中性粒細(xì)胞的升高可能通過(guò)升高POT1參與早發(fā)冠心病的疾病過(guò)程。
　　(2)PCAD患者較之普通冠心病患者在發(fā)病過(guò)程中，粒細(xì)胞可能起到更重要作用。
　　(3)人單核巨噬細(xì)胞危險(xiǎn)因素刺激體外培養(yǎng)72小時(shí)端粒長(zhǎng)度無(wú)顯著變化;受到不同危險(xiǎn)因素刺激，PCAD組TRF2、POT1表達(dá)較冠造陰性顯著增加;較低水平危險(xiǎn)因素刺激即可誘導(dǎo)PCAD組TRF2、POT1的增加，顯示出其易感性。較大劑量危險(xiǎn)因素刺激可能