殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞靶向殺傷抗原特異性T細(xì)胞及抑制皮膚移植排斥的研究.pdf

1、系統(tǒng)性使用大劑量免疫抑制藥物治療移植排斥導(dǎo)致的眾多副作用，促使了針對移植排斥的特異性免疫療法的發(fā)展。選擇性清除或抑制同種反應(yīng)性T細(xì)胞是治療移植排斥的理想策略之一。因此，近十余年來，非細(xì)胞性的、以抗原肽/主要組織相容性抗原(peptide/major histocompatibility complex，p/MHC)為靶向的，針對抗原特異性T細(xì)胞的特異性殺傷制劑被廣泛研究。最新的進(jìn)展之一是在非細(xì)胞性載體表面包被pMHC多聚體和Fas配體，

2、制備殺傷性人工抗原遞呈細(xì)胞(Killer artificial antigen-presenting cells,KaAPCs)。其中以磁珠或膠乳微球為載體的KaAPCs已經(jīng)被報道能在體外選擇性殺傷抗原特異性T細(xì)胞。然而，此類載體不易在體內(nèi)生物降解，缺乏生物相容性，且在體內(nèi)和器官移植模型中的研究鮮有報道。
　　本研究是以可生物降解的聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球(Mic

3、roparticles，MPs)作為載體，在其表面共包被H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗，制備成基于PLGA的KaAPCs。其表面的H-2Kb-Ig二聚體可以裝載特定的抗原肽，形成p/MHC復(fù)合體，從而與抗原特異性T細(xì)胞的TCR靶向結(jié)合，同時其表面的anti-Fas單抗能夠誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞凋亡，達(dá)到靶向殺傷抗原特異性T細(xì)胞的目的。在同種異體移植模型中，KaAPCs表面的H-2Kb-Ig二聚體即作為同種抗原，與受者鼠體內(nèi)H

4、-2Kb同種抗原反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的TCR特異性結(jié)合，并利用anti-Fas單抗誘導(dǎo)活化的同種反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)對移植排斥的特異性免疫治療。
　　目的:
　　以O(shè)T-1轉(zhuǎn)基因小鼠為模型研究KaAPCs能否在體外和其體內(nèi)選擇性清除OVA257-264抗原特異性T細(xì)胞;并以小鼠同種異體皮膚移植為模型，分析KaAPCs特異性殺傷同種反應(yīng)性T細(xì)胞的能力和治療移植排斥的效果，進(jìn)而探討其在體內(nèi)的作用機(jī)制。
　　方法及結(jié)果:<

5、br>　　1、PLGA MPs的制備及表征:以PLGA聚合物為原材料，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備直徑約為5μm的PLGA MPs，并利用化學(xué)修飾法使其表面功能化（帶有NH2+）;通過掃描電鏡(Scanning Electronic Microscopy，SEM)、粒徑分析儀和Zeta電位分析儀對PLGA MPs進(jìn)行表征，并通過蛋白定量和流式技術(shù)分析其吸附蛋白的能力。結(jié)果顯示:PLGA MPs在SEM下呈現(xiàn)良好的球形，粒徑分布在1-10μm，

6、且80％的MPs集中在5-6μm，平均Zeta電位為65.2士6.7 mV，表明其帶有足夠電荷，2×107MPs對BSA的最大吸附量為80μg。以上結(jié)果表明自制的PLGA MPs具有良好的表征。
　　2、KaAPCs的制備及其表型分析:把PLGA MPs和H-2Kb-Ig二聚體以及anti-Fas單抗共孵育后，制備成KaAPCs，并經(jīng)特異性熒光單抗染色、流式細(xì)胞技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)驗證KaAPCs表型。結(jié)果顯示，H-2Kb-Ig二

7、聚體和anti-Fas單抗被成功共包被到PLGA MPs表面，表明所制的KaAPCs具有良好的表型。
　　3、KaAPCs靶向殺傷OVA257-264抗原特異性T細(xì)胞:在體外，把裝載OVA257-264的KaAPCs(Kb/OVA-KaAPC)與OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠（其CD8+T細(xì)胞TCR以H-2Kb限制的方式識別OVA257-264）的脾細(xì)胞共孵育24小時，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞群中CD8+T細(xì)胞的凋亡比例以及OVA257-26

8、4特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量比例。結(jié)果顯示:Kb/OVA-KaAPC能夠誘導(dǎo)大約80％的CD8+T細(xì)胞凋亡，OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞比例顯著下降83％左右。而無關(guān)抗原肽對照組沒有出現(xiàn)明顯凋亡，OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞沒有明顯減少，表明KaAPCs能夠在體外特異性地殺傷抗原特異性CD8+T細(xì)胞。其中anti-Fas介導(dǎo)的凋亡為主，活化誘導(dǎo)的凋亡(AlCD)極少。在體內(nèi)，Kb/OVA-KaAPC經(jīng)尾靜脈注入O

9、T-1鼠后，在不同時間點(diǎn)通過流式細(xì)胞術(shù)分析其外周血中CD8+T細(xì)胞的凋亡比例及OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量比例。結(jié)果與體外實驗相似，CD8+T細(xì)胞凋亡比例最高達(dá)75％左右，OVA257-264特異性CD8+T細(xì)胞的比例最高下降大約84％，而對照組無顯著變化。KaAPC的殺傷效率與其劑量、作用時間呈正相關(guān)。這表明KaAPC在體內(nèi)也能靶向殺傷抗原特異性的CD8+T細(xì)胞。
　　4、KaAPC抑制小鼠皮膚移植排斥的有效方

10、案的研究:以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為供受體，建立同種異體皮膚移植模型。KaAPCs（包被自制H-2Kb單體和商品化anti-Fas單抗）經(jīng)尾靜脈或局部注入受者鼠后，觀察移植皮塊的生存狀況，進(jìn)行臨床評分，并通過免疫熒光染色檢測移植皮塊中CD8+T和CD4+T細(xì)胞的浸潤量，同時多指標(biāo)監(jiān)測受者鼠的整體免疫功能。結(jié)果:比較多種方案的效果后，明確了靶向抗原和anti-Fas的包被劑量、KaAPCs的注射途徑、

11、劑量、次數(shù)和時間點(diǎn)等治療措施。據(jù)此，KaAPCs能顯著延長移植皮塊的生存時間達(dá)4-6天，并明顯減少移植皮塊中CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量，對CD4+T細(xì)胞無明顯影響，且不明顯抑制受者鼠的整體免疫功能。
　　5、KaAPC抑制小鼠皮膚移植排斥的優(yōu)化方案及其機(jī)制研究:以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bm1鼠（H-2Kbm1）為供受體，建立同種異體皮膚移植模型。在優(yōu)化方案下，經(jīng)三次尾靜脈注射KaAPCs（包被商品化H-2Kb-Ig二聚體和

12、商品化anti-Fas）治療受者鼠后，觀察移植皮塊的生存狀況和排斥程度;流式細(xì)胞術(shù)檢測受者鼠外周血和脾臟中T細(xì)胞的凋亡比例及H-2Kb同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞比例;免疫組化分析移植皮塊中浸潤的CD8+T、CD4+T細(xì)胞和H-2Kb同種反應(yīng)性T細(xì)胞的量;針對供體的同種增殖能力檢測;脾臟及淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測;KaAPCs對受者鼠脾臟中B、NK、T細(xì)胞以及外周血中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞群等的影響;通過抗腫瘤能力、T細(xì)胞庫針對第

13、三方抗原的同種增殖能力和NK細(xì)胞殺瘤能力的分析，監(jiān)測KaAPCs對受者鼠整體免疫功能的影響;觀察KaAPCs在體內(nèi)的運(yùn)行和分布。結(jié)果顯示:三次尾靜脈輸注后KaAPCs能經(jīng)血流進(jìn)入淋巴結(jié)和脾臟，并與CD8+T細(xì)胞直接接觸，有效地靶向殺傷外周血和脾臟中同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞，殺傷率達(dá)82％左右，從而大幅減少了同種反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞在移植皮塊中的浸潤，同時上調(diào)了淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平，最終延長移植皮塊的存活時間達(dá)42.5天，且對受者鼠