高溫對原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷的研究.pdf

1、中暑是嚴重威脅人類生命健康的疾病，發(fā)病率高，致死率高，致殘率高。隨著全球溫度變暖，發(fā)病率逐年上升。中暑可以引起全身多器官和系統(tǒng)的損害，對神經(jīng)系統(tǒng)的損害尤為明顯和嚴重。中暑患者可以出現(xiàn)頭痛、抽搐、意識喪失、躁狂、淡漠、認知功能下降等神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)。
　　有關(guān)中暑的研究中以人和動物為研究對象居多，但是面臨兩個問題就是:一、制造中暑的動物模型不統(tǒng)一，不同動物模型中動物加熱采用的高溫和時間各不相同[1-4]，這就會對各種實驗結(jié)果產(chǎn)生一定

2、的影響。繞過動物模型，直接加熱原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元，可以很好的解決上述矛盾。二、沒有全面掌握不同高溫情況對神經(jīng)元本身受到的傷害表現(xiàn)和規(guī)律特點。我們通過設(shè)定不同高溫和加熱時間的組合，全面觀察不同情況高溫處理下神經(jīng)元的病理變化，全面模擬高溫損傷后神經(jīng)元元損傷的病理變化規(guī)律，為進一步防治中暑奠定基礎(chǔ)。
　　我們通過大量實驗研究，摸索建立了一種新的通過新生乳鼠皮層培養(yǎng)高純度、高成活率、高產(chǎn)量神經(jīng)元的方法。通過在不同溫度和暴露時間加熱神

3、經(jīng)元，觀察不同高溫設(shè)置下神經(jīng)元的死亡率，探索高溫加熱神經(jīng)元后神經(jīng)元死亡的病理變化規(guī)律。同時我們還進一步研究了常見中暑情況下神經(jīng)元壞死和凋亡的具體情況以及相關(guān)蛋白Cas-3、HSP70含量的變化，為進一步防治中暑做了初步的研究。
　　第一部分 構(gòu)建改良的大鼠原代皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)模型
　　目的:建立穩(wěn)定的高純度、低死亡率的大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法。
　　方法:參考Beaudoin等人[5]和Giordano G等人[6]、王

4、旭輝等人[7]的實驗方法，并經(jīng)過適當(dāng)摸索改進。采用新生12h內(nèi)的Wistar大鼠，麻醉后低溫下干凈分離出雙側(cè)大腦皮層，剪碎組織后予胰酶消化，消化后輕柔吹打組織，然后過濾再離心，棄上清并添加適量接種液，輕輕吹勻后再次過濾，光鏡下計數(shù)細胞密度，用接種液稀釋至適當(dāng)濃度接種。接種后第4h、45h、96h全量更換培養(yǎng)液。
　　結(jié)果:神經(jīng)元培養(yǎng)第5天，光鏡下見神經(jīng)元形態(tài)飽滿透亮、背景干凈，固縮的死亡細胞少。行神經(jīng)元特異性標志物NSE免疫組化鑒

5、定，NSE陽性率超過95％。行NMDAR1抗體染色，觀察發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細胞突起長、交聯(lián)豐富充分。行臺盼蘭染色，陽性細胞非常少，神經(jīng)元死亡率小于5％。
　　結(jié)論:建立了一套簡便、穩(wěn)定、高純度、低死亡率、高產(chǎn)量、低背景的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法。
　　第二部分 不同高溫和暴露時間處理下神經(jīng)元損傷情況的研究
　　目的:探索不同高溫和暴露時間處理下神經(jīng)元的病理改變和死亡情況的變化規(guī)律。
　　方法:神經(jīng)元培養(yǎng)第5d，在37℃5％CO

6、2培養(yǎng)箱中分別給予細胞39℃、41℃、43℃、45℃、47℃加熱，加熱45min或者1h。加熱24h后，光鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)改變;臺盼蘭染色后觀察細胞形態(tài)并統(tǒng)計各個模式下細胞的死亡率;Annexin/PI染色后熒光顯微鏡下觀察細胞在各種溫度下壞死和凋亡情況。
　　結(jié)果:加熱45min情況下，神經(jīng)元對熱不敏感，最高可以耐受45℃的高溫。加熱1h的情況下，隨著溫度逐漸升高，神經(jīng)元死亡率逐漸增高。43℃及以下的高溫作用1h，神經(jīng)元死亡以

7、凋亡為主。45度及以上高溫作用1h，神經(jīng)元死亡以壞死為主。
　　結(jié)論:不同高溫和暴露時間是影響神經(jīng)元死亡率的重要因素。神經(jīng)元可以最高耐受45℃度的高溫45min。43度以下的熱打擊主要造成神經(jīng)元部分凋亡，43度以上的高溫，神經(jīng)元開始大面積壞死。
　　第三部分 模擬臨床常見高溫中暑情況下神經(jīng)元損傷的進一步研究
　　目的:探索臨床常見致中暑溫度下神經(jīng)元壞死凋亡的具體情況以及相關(guān)蛋白的變化規(guī)律。
　　方法:神經(jīng)元培養(yǎng)第

8、5d，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中分別給予細胞41℃、43℃加熱1h。加熱24h后，光鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化;Annexin/PI熒光雙標染色后流式細胞儀計數(shù)神經(jīng)元壞死、凋亡比例并統(tǒng)計學(xué)分析;免疫細胞化學(xué)染色Cas-3、HSP70，Image-Pro Plus6.0軟件進行IOD值的掃描后統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:神經(jīng)元41℃、43℃加熱1h后，神經(jīng)元小部分死亡，以細胞凋亡為主，溫度越高凋亡細胞越多。存活細胞形態(tài)無明顯變化。Caspas