microRNA-133b調控在脊髓損傷再生修復中作用的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷是一種常見的脊柱外科傷病，多見于高處墜落、交通意外、運動傷害及暴力傷害，近年來發(fā)病率逐漸增高。脊髓損傷可造成嚴重的感覺及運動的功能障礙，且預后較差。尤其是頸段脊髓損傷，不僅最為常見、傷情最為嚴重，且累及上肢及手的功能，嚴重損害了患者的自理能力和生活質量。探明脊髓損傷的內(nèi)在病理機制，尋找有效的干預靶點，并在此基礎上尋求改善脊髓損傷患者運動功能預后的方法，是該領域研究中的熱點與難點。
　　microRNA是一種通過調控靶mRN

2、A，而調節(jié)蛋白表達功能的單鏈非編碼RNA。近年的研究提示了脊髓損傷后出現(xiàn)了miRNA失調。而這些失調的miRNA從不同的途徑參與到了脊髓損傷后炎癥反應、細胞凋亡和軸突再生抑制的過程中。其中有研究提示miRNA-133b對于神經(jīng)細胞軸突的生長具有促進作用，但目前對于其在哺乳動物脊髓損傷病理過程及再生修復中作用的體內(nèi)研究尚無報道。
　　第一部分 頸脊髓鈍挫傷小鼠行為學分析與miR-133b表達分析
　　目的：
　　建立一個

3、穩(wěn)定的小鼠頸脊髓鈍挫傷模型，分析其運動功能變化趨勢，并明確脊髓損傷后不同時間點miR-133b表達變化。
　　方法：
　　訓練小鼠抓握能力，以完成損傷后的握力測量。實驗小鼠分為。損傷組:行頸5脊髓鈍挫傷造模，使用Infinite Horizon脊髓打擊儀以80Kdyn劑量急性脊髓打擊。;假手術組:行單純椎板切除術。在損傷前及損傷后各時間點點進行前肢握力測量、前肢運動功能評分。在損傷后使用qRT-PCR方法檢測各組小鼠脊髓損傷

4、區(qū)成熟miR-133b表達變化。
　　結果：
　　假手術組小鼠在術后早期因手術傷口疼痛，出現(xiàn)握力測量值的暫時下降。自手術后1周，傷口逐漸恢復，握力值亦逐漸恢復至術前水平。手術后，損傷組小鼠在最初1周內(nèi)，四肢運動功能嚴重損傷，無法使用前爪進行任何動作;自7d-14d進行握力測量時，小鼠嘗試抓握測量桿，但無法完成成功的抓握，或及時能夠完成抓握，但無法抵抗牽拉，完成測量。自21d-56d可配合完成測量，前爪握力隨時間逐漸出現(xiàn)輕微改

5、善，但明顯低于術前水平，表明存在嚴重的運動功能障礙。術后各時間點，損傷組小鼠握力值均顯著低于假手術組小鼠握力值(P＜0.05)。
　　假手術組小鼠各個時間點脊髓成熟miR-133b的表達維持在穩(wěn)定水平，各時間點的相對表達量值之間無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。以假手術組小鼠脊髓成熟miR-133b表達作為對照組，損傷組小鼠自損傷后第1天成熟miR-133b表達略上升，但與對照組無統(tǒng)計學差異(p＞0.05);損傷后第3天，損傷組小鼠脊

6、髓成熟miR-133b表達開始下降，損傷后第7天，成熟miR-133b表達降至最低值，損傷后第14天，略微回升，但仍低于對照組(p＜0.05)。
　　結論：
　　握力測量是評估脊髓損傷小鼠的前肢運動功能敏感、可靠的實驗方法。而脊髓損傷后miR-133b會隨時間出現(xiàn)顯著的下調。
　　第二部分 miR-133b對下游靶基因表達的影響
　　目的：
　　探尋脊髓損傷病理過程中miR-133b的關鍵下游靶mRNA，并

7、探討miR-133b對這些靶mRNA的調控作用。
　　方法：
　　分別使用外源性miR-133bmimic、miR-133b抑制劑、miR-陰性對照對小鼠脊髓損傷區(qū)顯微注射進行過表達、低表達和陰性對照。在損傷后各時間點采集標本，使用qRT-PCR檢測小鼠脊髓損傷區(qū)成熟miR-133b表達變化。使用生物信息數(shù)據(jù)庫篩選miR-133b與神經(jīng)生長、細胞凋亡等相關的靶mRNA，使用qRT-PCR及Western Blot檢測各組小鼠

8、相關靶基因的表達變化。
　　結果：
　　脊髓損傷發(fā)生后，各組小鼠損傷區(qū)成熟miR-133b表達水平均隨時間發(fā)生了顯著的變化。與相同時間點單純損傷組相比，陰性對照組小鼠成熟miR-133b均無顯著變化;miR-133b組小鼠各時間點成熟miR-133b表達較手術組和陰性對照組顯著升高(p＜0.05)，其中在術后第3天達到最高值;抑制劑組小鼠各時間點成熟miR-133b表達則低于手術組和陰性對照(p＜0.05)。
　　生物

9、信息數(shù)據(jù)庫篩選出的關鍵下游靶基因包括RhoA、Stathmin4，而Stathmin1作為Stathmin4的同家族成員，具有高度相似的編碼和結構，亦納入研究。qRT-PCR和Western blot的結果提示單純損傷組小鼠脊髓損傷區(qū)RhoA蛋白表達水平隨時間出現(xiàn)上調、Stathmin1蛋白表達水平隨時間出現(xiàn)下調;與同時間點單純損傷組小鼠相比，miR-133b組小鼠RhoA蛋白表達水平下調、Stathmin1蛋白表達水平上調。
　

10、　結論：
　　外源性miR-133b mimic可通過局部注射方法被受損組織有效攝取并進入代謝環(huán)節(jié)生成成熟miR-133b，同時誘導了RhoA和Stathmin1這兩種重要的神經(jīng)生長調節(jié)蛋白的表達改變。提示脊髓損傷后miR-133b表達水平的變化可能通過調控RhoA/ROCK途徑和Stathmin1，參與脊髓神經(jīng)軸突再生修復過程。
　　第三部分 miR-133b對小鼠脊髓損傷修復再生的影響
　　目的：
　　探討m

11、iR-133b對損傷小鼠皮質脊髓束軸突再生、神經(jīng)細胞凋亡情況的影響，評估小鼠運動功能變化。
　　方法：
　　分別使用miR-133b mimic、miR-陰性對照和miR-133b抑制劑對脊髓損傷后小鼠損傷局部進行注射。通過握力測量評估小鼠運動功能的恢復情況;通過皮質脊髓束BDA示蹤和軸突計數(shù)評估損傷后軸突再生情況;通過Western blot檢測凋亡caspase3等凋亡相關蛋白表達，評估細胞凋亡情況;通過免疫熒光GFAP

12、與DAPI共染色評估細胞形態(tài)、生長趨勢和細胞凋亡情況。
　　結果：
　　miR-133b治療組小鼠在損傷后第7天起部分小鼠前爪功能便出現(xiàn)了初步的恢復，握力隨時間逐步改善。損傷后28d-56d治療組小鼠握力較同期單純損傷組改善。抑制劑組小鼠損傷后的前肢運動功能恢復較慢，在損傷后14天，該組小鼠仍無法完成成功的抓握測試。直到損傷后21天，小鼠握力才出現(xiàn)逐步改善。但各時間點該組小鼠左右前爪單獨握力及雙爪同時握力均明顯低于同期單純損

13、傷組小鼠(P＜0.05)。
　　對比各組損傷區(qū)下段各切層軸突的相對計數(shù)發(fā)現(xiàn)，單純損傷組小鼠與miR陰性對照組間統(tǒng)計學差異不明顯(p＞0.05)。而miR-133b組小鼠損傷區(qū)下段各切層軸突的相對計數(shù)均高于單純損傷組(P＜0.05)。
　　通過比較各組小鼠損傷區(qū)凋亡蛋白Caspase3表達量，評估細胞凋亡程度。結果顯示在損傷后3天、7天，miR-133b治療組小鼠損傷區(qū)Caspase3蛋白表達均低于同時期單純損傷組小鼠。

14、>　　與單純脊髓損傷組相比，在miR-133b治療組小鼠脊髓損傷區(qū)切片中可見GFAP標記的膠質細胞分布更加規(guī)律，且有向損傷區(qū)外長入的趨勢;miR-133b組小鼠DAPI標記的凋亡細胞顯著低于脊髓損傷組。
　　結論：
　　過表達miR-133b可使小鼠脊髓損傷區(qū)的軸突向損傷區(qū)外周長入，并減少神經(jīng)細胞的凋亡，最終使脊髓損傷小鼠獲得運動功能的部分改善;而抑制miR-133b則明顯減緩了小鼠脊髓損傷后自主修復過程。提示了miR-13