青蒿琥酯對破骨細胞的作用和分子機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究主要包括三部分內(nèi)容:1.青蒿琥酯對RANKL誘導的破骨細胞及小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松的影響;2.青蒿琥酯對RANKL誘導的破骨細胞作用機制;3．青蒿琥酯對LPS誘導的破骨細胞及小鼠急性骨破壞的影響和作用機制。
　　實驗方法：
　　1.通過MTT法考察3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯于8h、24 h、48 h、7d對RAW264.7細胞的毒性，以確定其體外實驗濃度。利用RAW264.7細胞和骨髓來源

2、的巨噬細胞(BMMs)兩種細胞建立體外RANKL誘導的破骨細胞培養(yǎng)體系，通過TRAP染色法考察3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯對RANKL誘導RAW264.7細胞和BMMs轉(zhuǎn)化成破骨細胞的影響并以Real-time PCR檢測破骨細胞相關(guān)基因c-Src、Fra-2、TRAP、β3-Integrin、Cathepsin K、MMP-9、DC-STAMP和Atp6v0d2等mRNA表達水平進行驗證，以驗證青蒿琥酯對破骨細胞生成和骨

3、吸收功能的影響。利用Osteo Assay Surface96-well Plate板通過骨吸收陷窩實驗評價3.125、6.25和12.5μM濃度的青蒿琥酯對RANKL誘導的破骨細胞破骨活性的影響。
　　2.青蒿琥酯抑制RANKL誘導的破骨細胞生成的作用機制。首先采用Real-time PCR、Western blot和熒光素酶報道基因技術(shù)，分別檢測NFATc1轉(zhuǎn)錄基因的mRNA、NFATc1蛋白和熒光素酶報道基因表達水平變化，從

4、三個不同側(cè)面考察青蒿琥酯對核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1活化的影響。Western blot檢測青蒿琥酯對RANKL誘導的NF ATc1信號通路上游蛋白鈣調(diào)磷酸酶表達的影響。通過以Fluo-3/AM作為Ca2+探針的confocal技術(shù)考察青蒿琥酯對200s內(nèi)RANKL誘導的細胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響。利用Western blot技術(shù)檢測青蒿琥酯對RANKL誘導的PLCγ1磷酸化的影響。通過Real-time PCR和Western blot

5、技術(shù)檢測青蒿琥酯對RANKL/RANK信號通路上游信號分子RANK、TRAF6表達的影響。最后通過熒光素酶報道基因技術(shù)檢測RANKL刺激RAW264.7細胞NF-κB報告基因表達變化，以考察青蒿琥酯對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　3.建立體外LPS誘導RAW264.7細胞的破骨細胞培養(yǎng)體系，通過TRAP染色法考察青蒿琥酯在3.125、6.25和12.5μM濃度下對LPS誘導RAW264.7細胞轉(zhuǎn)化成破骨細胞的影響;采用Real-

6、time PCR技術(shù)，檢測3.125μM和12.5μM濃度的青蒿琥酯對LPS誘導的RAW264.7細胞向破骨細胞轉(zhuǎn)化過程中破骨細胞相關(guān)因子Fra-2、TRAP、β3-Integrin、Cathepsin K、DC-STAMP和Atp6v0d2等mRNA表達水平的影響，以進一步證實青蒿琥酯對破骨細胞生成的影響。通過ELISA技術(shù)檢測不同濃度的青蒿琥酯（3.125、6.25和12.5μM）對體外LPS誘導RAW264.7細胞釋放TNF-α的

7、影響。建立LPS誘導的小鼠急性骨破壞模型:分別于第0d和第4d腹腔注射LPS5 mg/kg建立模型，腹腔注射青蒿琥酯10mg/kg/d進行藥物干預，共8d。通過考察對模型動物骨參數(shù)（骨礦物質(zhì)密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量和骨小梁分離度）及血清中TNF-α等指標的影響，評價青蒿琥酯對炎癥性骨破壞的影響。
　　結(jié)果：
　　1．MTT實驗發(fā)現(xiàn)除12.5μM青蒿琥酯干預24h、48 h、7d(生存率分別為分別為94.55％，P＜0.0

8、5;85.61％，P＜0.05和91.60％，P＜0.05)外，0-12.5μM青蒿琥酯7d內(nèi)對RAW264.7細胞無明顯影響。通過TRAP染色實驗發(fā)現(xiàn)3.125μM（P＜0.01）、6.25μM(P＜0.001)和12.5μM(P＜0.001)青蒿琥酯能夠顯著抑制體外RANKL誘導RAW264.7細胞分化成破骨細胞，并且呈劑量依賴性（F=124.566，P＜0.001）;與對RAW264.7結(jié)果一致，青蒿琥酯劑量依賴性地抑制RANKL

9、誘導BMMs分化成破骨細胞(=79.919，P＜0.001)。通過骨吸收陷窩實驗發(fā)現(xiàn)3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯能濃度依賴性地顯著減少骨陷窩面積(F=50.855，P=0.003)。通過Real-time PCR實驗發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠濃度依賴性地顯著抑制RANKL誘導的破骨細胞相關(guān)基因c-Src(F=245.807，P＜0.001)、Fra-2(F=102.631，P＜0.001)、β3-Integrin(F=21.97，P

10、＜0.001)、 Cathepsin K（F=510.220，P＜0.001）和MMP-9(F=88.322，P＜0.001)等mRNA表達水平上升，12.5μM濃度還對TRAP(F=403.031，P＜0.001)、DC-STAMP(F=23.369，P=0.001)和Atp6v0d2(F=427.932，P＜0.001)的mRNA表達水平。
　　2.對RANKL誘導的破骨細胞作用機制研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯3.125(P＜0.001

11、)和12.5μM(P＜0.001)濃度均能濃度依賴性地顯著抑制RANKL誘導的NFATc1基因水平上調(diào)（F=123.524，P＜0.001）;青蒿琥酯3.125-12.5μM濃度下能濃度依賴性地顯著增加胞漿無活性形式的NFATc1即p-NFATc1蛋白的表達量，同時也能濃度依賴性地顯著抑制細胞核內(nèi)NFATc1蛋白的表達，即青蒿琥酯能顯著抑制RANKL誘導的NFATc1核轉(zhuǎn)位;青蒿琥酯（3.125、6.25和12.5μM）與陽性對照藥Cs

12、A（1μM）均能顯著降低RANKL誘導的NFAT熒光素酶報告基因表達上升(F=26.590，P＜0.001)。上述三個不同層面的實驗結(jié)果提示，青蒿琥酯能抑制核轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的活化。青蒿琥酯在3.125-12.5μM濃度下顯著抑制RANKL對NFATc1信號通路上游分子PP2B-Aα蛋白的上調(diào)。3.125和12.5μM青蒿琥酯濃度依賴性地顯著降低細胞內(nèi)Ca2+濃度(F=19.570，P＜0.001)，特別是12.5μM青蒿琥酯與陽性

13、對照藥CsA降低細胞內(nèi)Ca2+濃度的作用接近于空白對照組。3.125-12.5μM青蒿琥酯濃度依賴性地抑制RANKL誘導的Ca2+信號通路上游分子p-PLCγ1蛋白水平的上調(diào)。青蒿琥酯濃度依賴性抑制RANKL/RANK信號通路上游信號分子TRAF6基因(F=41.395，P＜0.001)和蛋白表達;12.5μM青蒿琥酯能顯著抑制上游信號分子RANK基因表達(F=30.819，P＜0.001)。陽性對照藥NF-κB抑制劑BAY11-708

14、2在5μM濃度下能顯著抑制RANKL誘導的NF-κB報告基因表達上升，抑制率約50％(P＜0.05)。但是，但是，僅50μM濃度(P＜0.05)的青蒿琥酯對RANKL誘導的NF-κB報告基因表達上升呈現(xiàn)抑制效應，3.125-25μM濃度下未見抑制效應。提示青蒿琥酯可能不是通過抑制NF-κB信號通路來影響OCs的生成與骨吸收功能。
　　3.通過TRAP染色實驗發(fā)現(xiàn)3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯能夠顯著抑制體外LPS誘導R

15、AW264.7細胞分化成破骨細胞，并且呈濃度依賴性(F=67.221，P＜0.001)。3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯能濃度依賴性地顯著抑制OCs培養(yǎng)液中LPS誘導的TNF-α上調(diào)（F=117.712，P＜0.001）。3.125μM和12.5μM青蒿琥酯顯著抑制LPS誘導的破骨細胞前體RAW264.7細胞的Fra-2(F=17.440，P＜0.001)、TRAP(F=40.550,P＜0.001)、Cathepsin K(

16、F=26.400,P＜0.000)、DC-STAMP(F=12.870，P=0.002)和Atp6v0d2(F=161.500，P＜0.001)等mRNA表達水平上升，12.5μM濃度還對β3-Integrin的mRNA表達水平具有顯著抑制效應(F=30.900，P＜0.001)。通過Micro-CT掃描分析小鼠股骨的影像學特征，發(fā)現(xiàn)10mg/kg青蒿琥酯能顯著恢復LPS誘導的急性骨破壞模型小鼠骨量降低;通過分析小鼠股骨骨參數(shù)發(fā)現(xiàn)，10

17、mg/kg青蒿琥酯能顯著升高小鼠骨礦物質(zhì)密度(F=7.217，P=0.014)、骨體積分數(shù)(F=6.621，P=0.017)、骨小梁數(shù)量(F=6.561，P=0.018)，降低骨小梁分離度(F=5.778，P=0.024);10 mg/kg青蒿琥酯能顯著降低LPS誘導的小鼠血清中TNF-α含量(F=10.85，P=0.004)。
　　結(jié)論：
　　1.青蒿琥酯能夠顯著抑制體外RANKL和LPS誘導破骨前體細胞分化形成破骨細胞，