鹽芥谷胱甘肽過氧化物酶基因的克隆及表達分析.pdf

1、谷胱甘肽過氧化物酶(GlutathionePeroxidases，GPXs)是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要酶類之一。植物GPXs起步較晚，而對一種植物中GPXs整個家族的研究更少，只在模式植物擬南芥、豆科植物百脈根、木本植物楊樹中進行了較為系統(tǒng)地研究，關(guān)于鹽生植物鹽芥中GPXs的系統(tǒng)研究未見報道。
　　 本研究以鹽芥(Thellungiellasalsuginea)為材料，進行了ThGPXs基因的克隆、序列的生物信息學分析、高

2、鹽和干旱脅迫下的表達模式分析，選取ThGPX6進行了亞細胞定位研究，獲得的結(jié)論如下:
　　 1.依據(jù)鹽芥EST序列和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，運用電子克隆、RACE技術(shù)克隆得到ThGPXs的8個基因的cDNA全長序列，依次命名為ThGPX1～ThGPX8。對其推測的氨基酸序列的理化性質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸數(shù)目介于167～236之間，分子量在18.9～26.3kDa之間，ThGPX2和ThGPX8為酸性蛋白，ThGPX3為中性蛋白，其他的均為堿

3、性蛋白。
　　 2.對ThGPXs的基因組分析結(jié)果表明，ThGPXs的CDS序列與基因組釋放的序列完全一致，但是UTR區(qū)的序列不盡相同。ThGPXs每個家族成員的ORF區(qū)域均由6個外顯子和5個內(nèi)含子構(gòu)成，內(nèi)含子的剪切位點符合真核生物GT-AG規(guī)則。UTR可占用單獨的外顯子。外顯子的長度具有高度保守性，三個保守結(jié)構(gòu)域在外顯子上的位置具有保守性。不同ThGPXs的順式作用元件不盡相同，除了含有光響應相關(guān)的元件外，主要含有激素響應和非

4、生物脅迫響應元件。
　　 3.生物信息學分析表明，ThGPXs的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主，β-折疊片較少，靠近C末端多為α-螺旋結(jié)構(gòu)。ThGPXs的三級結(jié)構(gòu)以二聚體形式存在，主要的差異點位于α-螺旋處。ThGPXs的8個成員皆有潛在的磷酸化位點，ThGPX6的總數(shù)最高。只有ThGPX3存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，推測為分泌蛋白;采用PSORT進行ThGPXs的亞細胞定位分析，各成員的亞細胞定位不同:ThGPX2分布于細胞質(zhì)中，ThGP

5、X3分布于細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，ThGPX6分布于線粒體中，ThGPX1、ThGPX7、ThGPX8分布于葉綠體中。
　　 4.采用熒光定量PCR分析結(jié)果表明，不同處理條件下或同一處理條件下不同組織中，ThGPXs的表達量不同，不同組織中不同基因響應不同類型的脅迫。300mmol/LNaC1處理引起根中的ThGPXs的表達量升高，24h達到最高水平。除了ThGPX7外，20％PEG6000脅迫處理48h能夠引起根中ThGPXs各成

6、員的上調(diào)表達。
　　 5.采用GFP構(gòu)建表達載體進行ThGPX6亞細胞定位實驗結(jié)果表明，ThGPX6存在于線粒體中，與預測結(jié)果一致，提示ThGPX6在清除ROS過程中起著重要作用。
　　 本研究對ThGPXs的結(jié)構(gòu)和功能有了一定的了解，但是GPXs的抗逆作用機理尚不清楚。另外，在自然環(huán)境下，植物通常受到多重脅迫刺激，比如干旱刺激伴隨著高溫、強光刺激等，深入研究植物GPXs在逆境脅迫下的抗氧化功能還存在著局限性，有待于進一