熒光蛋白文庫構建及FRET技術篩選鈣調(diào)素結(jié)合蛋白.pdf

1、Ca2＋是細胞中普遍存在的第二信號分子，它調(diào)控許多不同的細胞內(nèi)進程，包括細胞增殖，發(fā)育，遷移，分泌，學習和記憶。鈣調(diào)素（CaM）是細胞內(nèi)Ca2+信號的主要受體，在細胞增殖、分化、凋亡、遷移等過程中都起著重要作用。由于CaM 本身并不具有任何酶活性，其發(fā)揮生物學效應的關鍵在于它能夠和鈣調(diào)蛋白效應因子結(jié)合，引起這些效應因子生物學活性的改變，進而參與生命活動的調(diào)控。
　　 因此，研究鈣調(diào)蛋白效應因子有助于進一步揭示CaM的生理功能。為

2、了更好地研究CaM在細胞周期調(diào)控中的重要作用，就要試圖找到CaM在周期細胞中的下游效應因子。為此我們設計了一種新型大規(guī)模篩選CaM 結(jié)合蛋白的實驗。
　　 我們通過Cre-loxP位點特異性重組技術構建了一個帶有CFP 熒光蛋白標記的文庫，與YFP-CaM 共同轉(zhuǎn)染細胞，進行熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）檢測。如果發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移并且計算結(jié)果在可信范圍內(nèi)，則認為與CaM 發(fā)生相互作用。利用膜片鉗微電極玻璃毛細管吸取發(fā)生FRET

3、的單個細胞，進行單細胞PCR。
　　 測序擴增出的片段，通過與已知蛋白序列數(shù)據(jù)庫進行比對，得出與CaM 相互作用的蛋白。通過這種手段我們可以篩選出未知的與CaM 相互作用的蛋白，從而為進一步研究CaM 蛋白在生理環(huán)境下的作用提供條件。甚至，我們可以利用這個方法篩選任意兩種相互作用的蛋白，從而豐富了大規(guī)模篩選的方法。目前我們已經(jīng)通過這種方法成功的篩選到了一些與CaM 相結(jié)合的蛋白。從而成功確立這一新的大規(guī)模篩選CaM 結(jié)合蛋白的方