志賀菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)與其耐藥關(guān)系的探討.pdf

1、志賀菌性痢疾是全球面臨的重要公共衛(wèi)生問題，尤其是發(fā)展中國(guó)家的重要傳染病之一。其病原體志賀菌屬是一類具有高度傳染性、危害較嚴(yán)重的革蘭陰性腸道致病菌，且其不斷增加的耐藥性問題為志賀菌性痢疾的有效治療增加困難。而耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移作為細(xì)菌獲得性耐藥的一個(gè)重要方式已引起廣泛關(guān)注。近年來人們發(fā)現(xiàn)成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPRs）與其相關(guān)基因序列(cas)編碼的Cas蛋白組成的CRISPR/Cas系統(tǒng)作為原核生物的獲得性和可遺傳性的新型

2、微生物防御系統(tǒng)，廣泛存在于古細(xì)菌和細(xì)菌基因組中，可以有效抵抗噬菌體感染及質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，限制外源性遺傳物質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移。這或許可以為解決細(xì)菌耐藥性的傳播提供幫助和新思路。但是目前CRISPR/Cas系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥關(guān)系的研究不多且未達(dá)成統(tǒng)一結(jié)論，機(jī)制尚不清楚?；诒菊n題組前期的研究進(jìn)展，進(jìn)一步研究志賀菌耐藥與CRISPR/Cas系統(tǒng)的關(guān)系。
　　方法:
　　1.采用瓊脂稀釋法測(cè)定志賀菌最低抑菌濃度(MIC)。
　　2.應(yīng)用P

3、CR擴(kuò)增，核酸序列分析志賀菌CRISPR/Cas系統(tǒng)相關(guān)位點(diǎn)。
　　3.應(yīng)用電穿孔法使敏感志賀菌獲得耐藥質(zhì)粒使其耐藥、次抑菌濃度氯霉素并倍增濃度法誘導(dǎo)敏感志賀菌耐藥、多耐藥志賀菌無(wú)抗生素壓力連續(xù)傳代后，應(yīng)用Clustal X2.1、Seqman、CRISPR Finder等分析CRISPR/Cas系統(tǒng)的變化。
　　4.應(yīng)用CRISPR Target和BLAST尋找spacer的同源質(zhì)粒和噬菌體，根據(jù)登記號(hào)在 NCBI或 Ge

4、nBank中尋找目標(biāo)質(zhì)粒或噬菌體上的耐藥信息；應(yīng)用Bioedit軟件尋找GenBank中志賀菌的耐藥信息，本實(shí)驗(yàn)室保存的臨床分離的志賀菌的耐藥基因前期已用PCR方法檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.志賀菌mel-sf1998024/zz經(jīng)耐藥質(zhì)粒PHSG398電轉(zhuǎn)化后CRISPR/Cas的各相關(guān)點(diǎn)均未見改變，志賀菌mel-sf2005127/hn的轉(zhuǎn)化子的cse2位點(diǎn)經(jīng)電轉(zhuǎn)化后有IS600插入，余均未見改變。
　　2.三株志

5、賀菌經(jīng)氯霉素誘導(dǎo)耐藥后對(duì)不同抗生素的敏感性均有不同程度的降低；CRISPR/Cas系統(tǒng)的各相關(guān)位點(diǎn)均未見改變。
　　3.四株耐藥譜不同的志賀菌經(jīng)無(wú)抗生素壓力傳90代后對(duì)某些抗生素的敏感性有不同程度的增加；志賀菌mel-sf1998024/zz和mel-sf2013004/bj經(jīng)無(wú)抗生素壓力傳代后CRISPR3位點(diǎn)的3’端的重復(fù)-間隔序列丟失；其余均未見改變。
　　4.數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床分離的志賀菌中共52條spacer，其中有7個(gè)

6、spacer與4個(gè)攜帶耐藥基因的質(zhì)粒同源；志賀菌的spacer同源的質(zhì)粒與該志賀菌耐藥信息分布存在相似性：間隔序列CRISPR2-mel-3同源的質(zhì)粒pUMNF18_IncFV及攜帶該間隔序列的志賀菌mel-ss1998011/zz、mel-ss1998024/zz、mel-sf2005082/sx、mel-sf2013004/bj均發(fā)現(xiàn)含有相同的耐藥基因blaTEM、aadA2和dfrA12，間隔序列CRISPR-Q1-S1、CRIS

7、PR-Q4-S1同源的質(zhì)粒pM5A24P及該間隔序列所在志賀菌 sd1012中均發(fā)現(xiàn)攜帶有耐藥基因 ampC和tetB；間隔序列CRISPR3-mel-33同源質(zhì)粒 plasmid:5與該間隔序列所在志賀菌mel-sf2000102/zz均攜帶相同的耐藥基因ampH、mrdA，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)二者均攜帶毒力相關(guān)基因yafO、yafN、virK、ldrB、ychO，同時(shí)在該質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)I-F型CRISPR/cas系統(tǒng)的存在。
　　結(jié)論:

8、
　　1.在電轉(zhuǎn)化入耐藥質(zhì)粒的條件下，志賀菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)可能并不發(fā)揮相應(yīng)功能。
　　2.高濃度的氯霉素可能會(huì)激活志賀菌外輸泵蛋白使細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥；氯霉素的抗生素壓力可能并不對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)產(chǎn)生影響。
　　3.志賀菌在無(wú)抗生素壓力下可降低或丟失對(duì)某些抗生素的耐藥性；志賀菌中CRISPR3位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)存在動(dòng)態(tài)變化的過程，且CRISPR3位點(diǎn)與cas基因可能存在共進(jìn)化。
　　4.在最初獲得新