抗CD20納米抗體梳的構(gòu)建及其抗淋巴瘤作用研究.pdf

1、[研究目的]:應(yīng)用納米技術(shù)，構(gòu)建抗CD20納米抗體梳，研究其對非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的體內(nèi)外抗腫瘤作用及相關(guān)作用機(jī)制，為臨床上提高非霍奇金淋巴瘤靶向治療效果和解決利妥昔單抗的耐藥問題提供新的思路和方法。
　　[研究方法]:應(yīng)用納米技術(shù)，用分子量為70kDa聚乙烯亞胺(PEI)載體將兩種不同類型的CD20抗體（Ⅰ型抗體利妥昔單抗，Ⅱ型抗體托西莫單抗）進(jìn)行交聯(lián)，構(gòu)建梳狀的CD20抗體納米團(tuán)簇，我們將其命名為抗CD20納米抗體梳，標(biāo)記為PP

2、RT(PEI-Polymer-Rituximab-Tositumomab)。隨后用動態(tài)光散射儀(DLS)比較PPRT納米抗體梳和游離單克隆抗體的粒徑大小，原子力顯微鏡(AFM)觀察PPRT納米抗體梳的顯微形態(tài)，SDS-PAGE驗(yàn)證抗體與PEI載體的成功連接。體外實(shí)驗(yàn)中，分離新鮮人血清和人外周血淋巴瘤細(xì)胞(PBMC)作為補(bǔ)體和效應(yīng)細(xì)胞的來源，分別與淋巴瘤細(xì)胞及抗體孵育后，比較游離CD20抗體和PPRT納米抗體梳體外誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的補(bǔ)體依賴

3、的細(xì)胞毒作用(Complement Dependent Cytotoxicity, CDC)、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Antibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity，ADCC)。AnnexinⅤ&PI雙染后，流式細(xì)胞術(shù)檢測PPRT納米抗體梳誘導(dǎo)靶細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)的能力。溶酶體探針染色后，流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡比較游離抗體和PPR

4、T納米抗體梳處理后，淋巴瘤細(xì)胞溶酶體變化及其內(nèi)容物的釋放。JC-1染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測靶細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況，并用免疫熒光技術(shù)染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察靶細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C從線粒體的釋放情況。用Invitrogen公司FAM PolyCaspases Assay Kit染色后，流式細(xì)胞術(shù)比較游離抗體和PPRT納米抗體梳處理后，淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)Caspase激活情況，并用Western Blotting技術(shù)檢測PPRT處理后，淋巴瘤細(xì)

5、胞內(nèi)Caspase9和Caspase3的活化情況。使用光學(xué)顯微鏡觀察并比較游離CD20抗體和PPRT納米抗體梳處理后，淋巴瘤細(xì)胞的同源粘附情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們分別對ICR小鼠注射相同劑量的游離抗體和PPRT納米抗體梳，并于不同時間點(diǎn)眼眶取血，ELISA檢測其血液濃度，PK-software分析其藥代動力學(xué)參數(shù)。在體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究中，我們分別構(gòu)建非霍奇金淋巴瘤的血液學(xué)模型和皮下腫瘤模型，比較游離抗體和PPRT納米抗體梳對荷瘤小鼠生存率

6、以及皮下腫瘤負(fù)荷的影響。為了檢測PPRT納米抗體梳對耐藥淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用，本研究在體外應(yīng)用“梯度加藥法”成功誘導(dǎo)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的耐藥，構(gòu)建了兩株對利妥昔單抗耐藥的淋巴瘤細(xì)胞株（Raji-R和JeKo-1-R），隨后分別按照上述研究方法，檢測了PPRT納米抗體梳對耐藥淋巴瘤細(xì)胞株的體內(nèi)和體外殺傷作用，并探討其誘導(dǎo)耐藥淋巴瘤細(xì)胞程序性死亡的主要機(jī)制。
　　[研究結(jié)果]:本研究成功構(gòu)建了抗CD20納米抗體梳PPRT。動態(tài)光散射結(jié)

7、果表明，游離抗CD20抗體的平均半徑約為7nm，而本研究構(gòu)建的PPRT納米抗體梳的平均半徑約為170nm。SDS-PAGE結(jié)果表明，PPRT納米抗體梳擁有較大的分子量，這種較大分子量是抗體與載體成功連接的有力證據(jù)。隨后用免疫熒光標(biāo)記法對PPRT納米抗體梳與CD20抗原的結(jié)合和解離能力進(jìn)行了檢測，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與游離抗體相比，PPRT納米抗體梳對靶細(xì)胞表面的CD20的結(jié)合能力相當(dāng)，而解離能力則大大下降，這是PPRT納米抗體梳持久抗腫

8、瘤效應(yīng)的微觀基礎(chǔ)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPRT納米抗體梳可以通過CDC、ADCC和誘導(dǎo)程序性死亡三條途徑殺傷淋巴瘤細(xì)胞。隨后探討了PPRT納米抗體梳誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制，結(jié)果表明PPRT納米抗體梳能夠激活淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)兩條獨(dú)立的與程序性死亡相關(guān)的通路:(1)由于細(xì)胞膜上抗原抗體復(fù)合物的交聯(lián)（“細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)”）而激活的經(jīng)典的Caspase通路;(2)由Ⅱ型CD20抗體托西莫單抗引起的與溶酶體相關(guān)的信號通路。多通路的激活，是PPRT納米

9、抗體梳極強(qiáng)誘導(dǎo)程序性死亡能力的分子基礎(chǔ)。此外，在研究中我們還發(fā)現(xiàn)，由于多個抗體同時連接在一個載體上，PPRT納米抗體梳能夠結(jié)合不同細(xì)胞上的CD20抗原，引起靶細(xì)胞的同源粘附，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對程序性死亡的敏感性，這種“跨細(xì)胞交聯(lián)”也是PPRT納米抗體梳極強(qiáng)的誘導(dǎo)程序性死亡能力的重要因素之一。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與游離抗體相比，PPRT納米抗體梳擁有更長的半衰期和更慢的血漿清除率，其在腫瘤組織內(nèi)部的富集較游離抗體更加明顯。與游離的抗體藥物相比，

10、PPRT納米抗體梳能顯著延長荷瘤小鼠的總體生存率(OS)和中位生存時間(MST)，降低荷瘤小鼠的腫瘤負(fù)荷。更為重要的是，本研究所構(gòu)建的PPRT納米抗體梳對對利妥昔單抗耐藥的淋巴瘤細(xì)胞仍然具有很好的殺傷效果。
　　[研究結(jié)論]:本研究中應(yīng)用納米技術(shù)將兩種不同類型的CD20抗體用聚乙烯亞胺載體成功交聯(lián)，構(gòu)建了一種新型的抗CD20納米抗體梳。構(gòu)建的PPRT納米抗體梳可以通過CDC、ADCC和誘導(dǎo)程序性死亡作用來殺傷淋巴瘤細(xì)胞，在體內(nèi)和體