P-p38MAPK在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發(fā)病不同時(shí)期脊髓組織的表達(dá)及SB203580保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點(diǎn)的自身免疫性疾病。具有反復(fù)發(fā)作與緩解、每況愈下的臨床特點(diǎn)，為青年人中最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。目前，同其他大多數(shù)自身免疫性疾病類似，MS的病因及發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論，通常認(rèn)為MS發(fā)病是個(gè)體遺傳易感傾向與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。其發(fā)病具體涉及免疫炎癥、氧化應(yīng)激等多種機(jī)制。其中CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥在致病過(guò)程中起到重要作用。CD4+T

2、細(xì)胞具有多種亞型，包括Th1細(xì)胞，Th2細(xì)胞，Th17細(xì)胞。其中以分泌IL-17為特征性細(xì)胞因子的Th17細(xì)胞在其發(fā)病及病程進(jìn)展中起到至關(guān)重要的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)新的信號(hào)通路p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路可以作用于Th17細(xì)胞分化的調(diào)控而受到極大的關(guān)注。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)為細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)傳遞者。p38 MAPK是MAPK家族中的重要組成部分，其主要在細(xì)胞應(yīng)激和炎癥刺激時(shí)被磷酸化激活，激活后的形式為p

3、-p38MAPK。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)p38MAPK、p-p38MAPK(p38MAPK激活形式)及IL-17在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠發(fā)病初期、高峰期、緩解期，于腰膨大處脊髓組織中動(dòng)態(tài)表達(dá)的研究，探討p38MAPK在EAE中可能的致病機(jī)制。
　　并且，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步應(yīng)用SB203580藥物對(duì)EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)，SB203580是一

4、種常用的p38MAPK抑制劑，其可以選擇性抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)CD4+T細(xì)胞中表達(dá)的主要p38MAPK亞型(p38α和p38βMAPK亞型)的磷酸化激活過(guò)程。應(yīng)用SB203580后，對(duì)小鼠EAE發(fā)病高峰期時(shí)的發(fā)病率、EAE嚴(yán)重程度、體重變化情況以及上述指標(biāo)表達(dá)水平的變化的研究，初步探索SB203580對(duì)MS動(dòng)物模型EAE小鼠的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為進(jìn)一步探討多發(fā)性硬化的致病機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供有具有實(shí)際意義的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:將

5、80只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、EAE初期組、EAE高峰期組、EAE緩解期組和SB203580組，每組16只。將EAE初期組、EAE高峰期組、EAE緩解期組和SB203580組以MOG35-55為抗原免疫C57BL/6小鼠建立EAE致病模型。自免疫當(dāng)天，SB203580組小鼠給予干預(yù)藥物SB203580以0.2mg/kg的計(jì)量每日腹腔注射，其余組小鼠均只給予等劑量的藥物溶劑二甲基亞砜(DMSO)每日腹腔注射，觀察小鼠的體重變

6、化、發(fā)病情況及神經(jīng)功能缺損評(píng)分。EAE初期組在EAE發(fā)病初期，即免疫后第13天留取標(biāo)本;EAE高峰期組和SB203580組小鼠在EAE高峰期，即免疫后第20天留取標(biāo)本;EAE緩解期組在EAE的緩解期，即免疫后第30天留取標(biāo)本。于上述相應(yīng)時(shí)期，留取各組小鼠腰膨大處組織進(jìn)行灌注取材，以HE染色觀察其炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度，以沙爾堅(jiān)牢藍(lán)染色觀察其脫髓鞘情況;于上述相應(yīng)時(shí)期留取各組小鼠腰膨大處組織進(jìn)行新鮮取材用于western blot技術(shù)檢測(cè)p38

7、MAPK、p-p38MAPK及IL-17蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、空白對(duì)照組、EAE高峰期組、SB203580組小鼠高峰期發(fā)病率相比:空白對(duì)照組小鼠始終未發(fā)病。SB203580組小鼠EAE的發(fā)病率較EAE高峰期組小鼠顯著降低（P＜0.05）。
　　2、空白對(duì)照組、EAE高峰期組、SB203580組小鼠高峰期神經(jīng)功能缺損評(píng)分相比:空白對(duì)照組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0。SB203580組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分同EAE

8、高峰期組小鼠相比明顯下降(P＜0.05)。
　　3、空白對(duì)照組、EAE高峰期組、SB203580組小鼠高峰期體重均數(shù)相比:EAE高峰期組及SB203580組小鼠體重出現(xiàn)不同程度減輕(P＜0.05)。其中EAE高峰期組較SB203580組小鼠體重減輕程度更加明顯(P＜0.05)。
　　4、EAE初期組、EAE高峰期組、EAE緩解期組與空白對(duì)照組相比，腰膨大處脊髓組織白質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)不同程度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘;EAE高峰期組同EAE

9、初期組及緩解期組相比，其炎性病灶數(shù)目及脫髓鞘嚴(yán)重程度和區(qū)域增多更為明顯;SB203580組同EAE高峰期組相比，其炎性病灶及脫髓鞘嚴(yán)重程度和區(qū)域有所縮小。
　　5、空白對(duì)照組、EAE初期組、EAE高峰期組、EAE緩解期組相比:p38MAPK在各組小鼠脊髓組織腰膨大處表達(dá)情況無(wú)明顯差異。而p-p38MAPK在EAE高峰期及EAE緩解期蛋白表達(dá)含量較空白對(duì)照組及EAE初期組明顯上升(P＜0.05)。IL-17在EAE高峰期組表達(dá)，與其

10、他各組相比明顯表達(dá)增多(P＜0.05)。
　　6、空白對(duì)照組、EAE高峰期組、SB203580組相比:p38MAPK在各組中的表達(dá)無(wú)明顯差異。p-p38MAPK、IL-17在SB203580組小鼠腰膨大處脊髓組織表達(dá)含量較EAE高峰期組相比表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、P38MAPK可以通過(guò)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥機(jī)制參與小鼠EAE的發(fā)病。
　　2、SB203580可以降低EAE小鼠的發(fā)病率、