縊蟶肝胰臟cDNA文庫(kù)構(gòu)建和免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、縊蟶(Sinonovacula constricta Lamarck)是我國(guó)重要的灘涂經(jīng)濟(jì)貝類，與牡蠣、蛤仔、泥蚶一起號(hào)稱我國(guó)“四大養(yǎng)殖貝類”。但是近年來，縊蟶病害經(jīng)常出現(xiàn)，大批死亡現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，提高縊蟶抗病能力是減少縊蟶病害發(fā)生的重要途徑。本研究構(gòu)建和分析了縊蟶肝胰臟cDNA文庫(kù)，篩選了免疫相關(guān)基因，應(yīng)用RACE技術(shù)以及長(zhǎng)PCR技術(shù)獲得了免疫相關(guān)基因cDNA和DNA全長(zhǎng)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了基因的組織表達(dá)以及細(xì)菌誘導(dǎo)后的時(shí)

2、間表達(dá)，以期獲得縊蟶的免疫候選基因，為縊蟶抗病新藥開發(fā)、抗病新品種選育等工作奠定基礎(chǔ)。
　　1.采用DNS酶均一化處理技術(shù)，構(gòu)建縊蟶肝胰臟cDNA文庫(kù)，共獲得5296個(gè)ESTs序列，經(jīng)拼接后獲得了4013個(gè)單一基因(Unigene)，其中包括540個(gè)重疊群(Contig)和3473個(gè)單一序列（Singleton）。通過BLAST分析，79.3％序列為未知基因，20.7％序列為已知功能基因，其中43條序列是免疫相關(guān)基因。根據(jù)其功能，

3、這些免疫相關(guān)基因可被分為5類，即20個(gè)蛋白酶和蛋白酶調(diào)節(jié)子基因、6個(gè)粘著蛋白基因、3個(gè)壓力蛋白基因、3個(gè)抗菌肽基因、6個(gè)溶酶體酶基因和5個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。
　　2.從文庫(kù)中篩選出2條β-actin同源序列，分別命名為β-ACTIN1和β-ACTIN2，cDNA全長(zhǎng)分別為1552 bp和1454 bp，均含有1131bp的開放閱讀框，同時(shí)通過同源克隆技術(shù)獲得縊蟶18S rRNA基因。比較分析了18S rRNA，β-ACTIN1和β-A

4、CTIN2基因的組織表達(dá)（水管、鰓、斧足、外套膜、肝胰臟和性腺）穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)18S rRNA基因最穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參基因。以18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，組織表達(dá)及鰻弧菌誘導(dǎo)后的時(shí)間表達(dá)分析結(jié)果顯示，2個(gè)β-actin基因的表達(dá)出現(xiàn)了顯著變化，表明2個(gè)β-actin基因不適合作為內(nèi)參基因。
　　3.從文庫(kù)中獲得2條與C型凝集素同源序列，cDNA全長(zhǎng)分別為644 bp和1659bp，分別命名為ScCTL-1和ScCTL-2。ScC

5、TL-1為標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)型C型凝集素，ScCTL-2為緊湊型C型凝集素，二者均具有1個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導(dǎo)后，縊蟶ScCTL-1和ScCTL-2 mRNA在不同組織中的時(shí)間表達(dá)譜變化趨勢(shì)不同，表明2個(gè)C型凝集素具有不同的功能。
　　4.從文庫(kù)中篩選出一條與半乳糖凝集素(Galectins)同源序列，cDNA全長(zhǎng)為1278 bp，具有識(shí)別半乳糖凝集素的特異性序列(H-NRP，WG-EE

6、)，命名為Sc-Galectin。預(yù)測(cè)蛋白包含2個(gè)串聯(lián)的CRDs蛋白結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)串聯(lián)重復(fù)型半乳糖凝集素。組織表達(dá)結(jié)果表明，Sc-Galectin mRNA在肝胰臟的表達(dá)量顯著高于其他組織。經(jīng)鰻弧菌處理8h和48h后，在6個(gè)組織中，縊蟶Sc-Galectin mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)，經(jīng)副溶血弧菌和鰻弧菌分別處理72 h和20 h后，在6個(gè)組織中，縊蟶Sc-Galectin mRNA的表達(dá)均顯著下調(diào)并達(dá)到最大值。
　　5.從文庫(kù)中

7、篩選出一條補(bǔ)體(Clq)同源序列，cDNA全長(zhǎng)為712 bp，命名為ScClq。預(yù)測(cè)蛋白包含一個(gè)18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和一個(gè)136個(gè)氨基酸的Clq結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)結(jié)果表明，ScClq mRNA在肝胰臟的表達(dá)量顯著高于其他組織。經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導(dǎo)后，縊蟶ScClq mRNA在6個(gè)組織中的表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)和下調(diào)，其中在水管、鰓、斧足、外套膜和性腺中的表達(dá)變化的趨勢(shì)比較明顯。
　　6.從文庫(kù)中篩選出一條鐵蛋白(ferritin

8、)同源序列，cDNA全長(zhǎng)為1106 bp，命名為ScFERs。預(yù)測(cè)蛋白包含一個(gè)高度保守的鐵氧化活性中心結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由7個(gè)與脊椎動(dòng)物H型鐵蛋白完全一致的氨基酸殘基組成，但是在5'非編碼區(qū)缺失鐵調(diào)節(jié)區(qū)域(IRE)。組織表達(dá)結(jié)果表明，ScFERs mRNA在肝胰臟的表達(dá)量顯著高于其他組織。經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導(dǎo)后，ScFERs mRNA在6個(gè)組織中的表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)和下調(diào)，其中在外套膜、斧足和性腺中的表達(dá)變化的趨勢(shì)比較明顯。

9、>　　7.從文庫(kù)中篩選出一條熱休克蛋白70(HSP70)同源序列，cDNA全長(zhǎng)為2335bp，是細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)型HSC70亞家族基因成員，被命名為Sc-Hsc70。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，ScHsc70 mRNA在外套膜中的表達(dá)量最低，而在水管中的表達(dá)量最高。經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導(dǎo)后，ScHsc70 mRNA在縊蟶肝胰臟組織的表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì)，且分別在20 h和30 h后達(dá)到最大。結(jié)果表明縊蟶ScHsc70基因可能在介導(dǎo)細(xì)菌誘導(dǎo)引起的

10、免疫應(yīng)答中起到重要作用。
　　8.從文庫(kù)中篩選出一條小熱休克蛋白(sHSP)同源序列，cDNA全長(zhǎng)為1220bp，該基因的氨基酸序列具有典型的小熱休克蛋白家族的特征結(jié)構(gòu):a-晶體蛋白(a-crystallin)結(jié)構(gòu)域，被命名為Sc-sHSP。組織表達(dá)結(jié)果表明，Sc-sHSP mRNA在肝胰臟的表達(dá)量顯著高于其他組織。經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導(dǎo)后，Sc-sHSPmRNA在肝胰臟組織的表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì)，且均在20 h后達(dá)到最大，結(jié)果表