耐受性樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)免疫性血小板減少癥小鼠免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以激活初始T細(xì)胞?？梢哉T導(dǎo)自身免疫耐受的DCs叫作耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenicdendritic cells，tDCs)。tDCs低表達(dá)MHCⅡ分子和共刺激分子，并在自身免疫病中發(fā)揮強(qiáng)有力的免疫調(diào)控能力。
　　免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種臨床常見的出血性疾病，以免疫介導(dǎo)

2、的血小板破壞和/或血小板生成抑制為主要特點(diǎn)。其主要的發(fā)病機(jī)制是識(shí)別自身血小板抗原的自身反應(yīng)性T細(xì)胞被激活，導(dǎo)致對(duì)自身血小板抗原的免疫耐受被打破。最近研究顯示，tDCs作為一種免疫細(xì)胞用于自身免疫紊亂的治療已取得成功，如自身免疫性腦脊髓炎、膠原或佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病等已有臨床試驗(yàn)報(bào)道。
　　我們參照國(guó)外有關(guān)文獻(xiàn)，用不同的細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)產(chǎn)生tDCs，用主動(dòng)免疫法建立ITP動(dòng)物模型，研究tDCs對(duì)ITP的防治作用，并探討其可能

3、機(jī)制。
　　研究目的:
　　1.探討不同細(xì)胞因子在誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenicdendritic cells，tDCs)中的作用，觀察不同因子組合培養(yǎng)條件下tDCs的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型和功能變化，尋找培養(yǎng)細(xì)胞所需要的最佳細(xì)胞因子;
　　2.建立免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)小鼠模型，觀察血小板數(shù)目、血小板平均體積等臨床指標(biāo)的變化;
　　3.探

4、討TGF-β1和IL-10聯(lián)合誘導(dǎo)的tDCs在ITP小鼠模型治療中的作用及其機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.tDCs的誘導(dǎo)培養(yǎng):采用C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞，分離單個(gè)核細(xì)胞。在含GM-CSF、IL-4、TGF-β1、IL-10或TGF-β1和IL-10兩種因子聯(lián)合的RPMI1640培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓tDCs，按不同的組合分為五組進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng):imDC組(GM-CSF+IL-4)、mDC組(GM-CSF+IL-4

5、+LPS)、10-DCs組(GM-CSF+IL-4+IL-10)、T-DCs組(GM-CSF+IL-4+ TGF-β1)、10T-DCs組(GM-CSF+IL-4+ IL-10+TGF-β1)。并利用GFP慢病毒感染tDCs細(xì)胞。光鏡及熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞CD80、CD86、I-A/I-E、CDllc、PD-L1、ILT3表達(dá)，WST法檢測(cè)各組DC細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖活性，qRT-PCR法檢測(cè)IL-12和CC

6、R7的mRNA表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10和TGF-β的分泌水平和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平。
　　2.ITP小鼠模型的建立:應(yīng)用抗血小板自身抗體MWReg30抗體（模型組）或PBS（對(duì)照組）腹腔免疫BALB/c純種小鼠，分別于免疫后的第1h，3h，24h，48h，72h，96h，120h取血檢測(cè)血常規(guī)，監(jiān)測(cè)血小板計(jì)數(shù)及平均血小板體積(MPV)水平的變化，并應(yīng)用流式細(xì)胞

7、術(shù)檢測(cè)血小板相關(guān)抗體(PAIgG)，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)外周血中Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10及TGF-β水平，同時(shí)觀察骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)，尤其是巨核細(xì)胞系的數(shù)量和發(fā)育情況。
　　3.tDCs在ITP小鼠模型治療中的作用及其機(jī)制研究:ITP小鼠體內(nèi)輸注GFP慢病毒轉(zhuǎn)染后的用GM-CSF、IL-4、IL-10、TGF-β細(xì)胞因子體外聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠tDCs。實(shí)驗(yàn)分兩組:治療組(輸tDCs)

8、和對(duì)照組(輸PBS)。輸注抗體1h后接受細(xì)胞或PBS治療，免疫熒光進(jìn)行細(xì)胞體內(nèi)定位的研究;于免疫后的第1h，3h，24h，48h，72h，96h，120h取血監(jiān)測(cè)血小板計(jì)數(shù)，應(yīng)用ELISA檢測(cè)外周血中Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10及TGF-β水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞，體外經(jīng)GM-

9、CSF、IL-4、IL-10和/或TGFβ聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)可生成耐受性樹突細(xì)胞(tDCs)。
　　2.各組tDCs的特點(diǎn):1）10-DCs，與mDCs相比，高表達(dá)DCs的特異性標(biāo)記物CD11c，低表達(dá)I-A/I-E和共刺激分子CD80和CD86，高表達(dá)抑制性分子PD-L1和ILT3;刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力降低;產(chǎn)生較低的IL-12和CCR7;分泌較高水平的IL-10和TGFβ;與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清中，IFNγ的水平較低，IL-10的水

10、平較高，但TGFβ的水平未有顯著變化。
　　2) T-DCs，與mDCs相比，高表達(dá)DCs的特異性標(biāo)記物CD11c，低表達(dá)I-A/I-E和共刺激分子CD80，高表達(dá)抑制性分子PD-L1和ILT3;刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力未顯著降低;產(chǎn)生的IL-12和CCR7未有顯著變化;分泌較高水平的TGFβ，IL-10的分泌量未有顯著變化;與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清中，IFNα的水平較低，IL-10和TGFβ的水平較高。
　　3)10T-DCs，

11、與mDCs相比，高表達(dá)DCs的特異性標(biāo)記物CD11c，低表達(dá)I-A/I-E和共刺激分子CD80和CD86，高表達(dá)抑制性分子PD-L1和ILT3;刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力降低;產(chǎn)生較低的IL-12，CCR7的表達(dá)無(wú)明顯變化;分泌較高水平的IL-10和TGFβ;與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清中，IFNγ的水平較低，IL-10和TGFβ的水平較高。
　　3.ITP小鼠模型的建立和相關(guān)檢測(cè):1）GFP慢病毒轉(zhuǎn)染tDCs后，細(xì)胞成功呈現(xiàn)綠色熒光，且并未

12、改變細(xì)胞的表型。
　　2) BALB/c小鼠接受MWReg30抗體腹腔注射，與對(duì)照組相比，1h后血小板數(shù)出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)，并在48h達(dá)到最低點(diǎn)，與對(duì)照組存在顯著性差異(P＜0.001)。并于120h回升至正常。
　　3)造模時(shí)，隨著血小板計(jì)數(shù)的下降，血小板平均體積相應(yīng)的增大，至24h時(shí)已與對(duì)照組存在顯著性差異(P＜0.05)，并于48h達(dá)到最大值并持續(xù)至120h(P＜0.001)，且血小板平均體積與血小板計(jì)數(shù)存在

13、負(fù)相關(guān)關(guān)系。而骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均無(wú)顯著變化。
　　4)造模組小鼠體內(nèi)的PAIgG水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5)造模組小鼠血清中IFN-γ和IL-4的水平均出現(xiàn)不同程度的升高。與小鼠未接受抗體注射(0 h)時(shí)的因子水平相比，IFN-γ在注射抗體3h后即出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，至120h恢復(fù)正常;而IL-4則在注射抗體24h后出現(xiàn)升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，至96h恢復(fù)正常。而IL-

14、2、IL-10及TGF-β因子水平均無(wú)明顯變化。
　　4.tDCs在ITP小鼠模型治療中的作用及其機(jī)制
　　1)10T-DCs治療組相比較PBS對(duì)照組明顯增加了ITP小鼠的血小板數(shù)目。
　　2)10T-DCs治療組小鼠外周血血清中的IFN-γ水平，相比較PBS對(duì)照組小鼠，在接受MWReg30抗體注射后3h、24h、48h、72h均有不同程度的下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而IL-4、IL-2、IL-10及T

15、GF-β其他因子水平均無(wú)明顯變化。
　　3)在熒光顯微鏡下觀察，10T-DCs治療組小鼠的脾臟內(nèi)可見呈綠色熒光細(xì)胞。
　　4)10T-DCs治療組小鼠外周血中Treg細(xì)胞的比例較PBS對(duì)照組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.GM-CSF、IL-4、IL-10和TGFβ聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)的tDCs效果最佳。
　　2.建立了理想并穩(wěn)定的ITP小鼠模型，為ITP細(xì)胞治療的后續(xù)研究提供了有力的保障。<