遺傳性毛發(fā)疾病的致病突變研究.pdf

1、第一部分先天性全身毛發(fā)增多癥中6q22微重復(fù)的鑒定
　　先天性全身毛發(fā)增多癥(congenital generalized hypertrichosis，CGH)以非雄激素依賴的全身性毛發(fā)過度生長為主要特征，具有表型異質(zhì)性及遺傳異質(zhì)性，臨床上分型較多，不同亞型之間表型有交疊。已發(fā)現(xiàn)的致病改變包括4號、8號、17號、X染色體重排，以及同樣位于17號染色體上的ABCA5基因點(diǎn)突變。
　　本研究收集一例CGH家系。先證者多毛表型接

2、近Ambras型，伴先天性視力不良及脊柱側(cè)彎，牙齒自30歲始至完全脫落，其雙親及同胞均表現(xiàn)正常。經(jīng)知情同意，采集先證者及其母親、所有四名同胞外周血或口腔上皮細(xì)胞，提取基因組DNA。微陣列比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aCGH)分析發(fā)現(xiàn)先證者6q22存在兩個微重復(fù)（依次稱為Dup1與Dup2），經(jīng)實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitive real-time poly

3、merase chain reaction，qPCR)驗(yàn)證在家系中與疾病表型共分離。隨后進(jìn)行一系列qPCR縮小兩個微重復(fù)邊界范圍，并嘗試多種gap-PCR組合方式最終克隆得到斷裂點(diǎn)。將gap-PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，結(jié)果顯示兩個微重復(fù)邊界彼此相連。結(jié)合雙色熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)結(jié)果推斷重排后染色體結(jié)構(gòu)。重復(fù)區(qū)內(nèi)STR提示先證者微重復(fù)為父源新生重復(fù)。
　

4、　此兩個微重復(fù)中共包含6個基因，其中GJA1基因?yàn)檠埤X指發(fā)育不良(ODDD)的致病基因，其拷貝數(shù)改變可能是患者眼睛與牙齒表型的原因;RSPO3與RNF146基因的功能與調(diào)節(jié)毛囊周期的Wnt通路相關(guān)，其拷貝數(shù)改變可能單獨(dú)或共同導(dǎo)致患者多毛的表型。
　　綜上所述，我們首次在CGH患者中發(fā)現(xiàn)6號染色體上的染色體重排，確定了重排后的染色體結(jié)構(gòu)，并推測兩個微重復(fù)為父源新生重復(fù)。
　　第二部分Bazex-Dupre-Christol綜合

5、征中Xq26.1微重復(fù)的鑒定
　　Bazex-Dupre-Christol綜合征(Bazex-Dupre-Christol syndrome，BDCS)是一種極罕見的遺傳病，其主要臨床表現(xiàn)為一個先天性毛發(fā)稀少、毛囊性皮膚萎縮與早發(fā)性基底細(xì)胞癌(basal cell carcinomas，BCCs)的三聯(lián)征。該病表型輕重不一，且易與其他疾病混淆，因此需進(jìn)行嚴(yán)格的鑒別診斷。BDCS呈現(xiàn)明顯的X連鎖顯性遺傳模式，目前定位至Xq25-q2

6、7.1一個11.4Mb的范圍內(nèi)，但該區(qū)域內(nèi)12個在毛囊中對細(xì)胞增殖分化起重要作用的候選基因中并未檢測到突變。
　　本課題組開展BDCS相關(guān)工作初期收集到兩個歐洲BDCS家系，通過全基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)分析，在Xq26.1上發(fā)現(xiàn)一段兩家患者共享的重復(fù)區(qū)，并經(jīng)qPCR驗(yàn)證在兩個家系中與疾病表型共分離。隨后，通過qPCR、gap-PCR及Sanger測序確定兩家的微重復(fù)范圍，其中家系2(

7、F2)精確至堿基水平，并推測了各自的重排機(jī)制。
　　為了進(jìn)一步探究該重復(fù)區(qū)域的致病性，本研究收集到另6個歐洲BDCS家系。本研究前期發(fā)現(xiàn)的微重復(fù)經(jīng)qPCR在其余6家患者中均得到驗(yàn)證，并結(jié)合gap-PCR及SNP位點(diǎn)擴(kuò)增測序的方法作為補(bǔ)充，確認(rèn)各家微重復(fù)在家系內(nèi)所有成員中均與疾病表型共分離。同時，在215個歐洲無關(guān)對照人群，共計(jì)354條X染色體中未發(fā)現(xiàn)類似的微重復(fù)。隨后，我們確定了新收集6家的微重復(fù)范圍，其中F4、F7、F9精確到堿

8、基水平，并推測了各自的重排機(jī)制。此外，我們還通過單體型分析，證明8家微重復(fù)為獨(dú)立發(fā)生。最后，我們構(gòu)建了Krt15組織特異性過表達(dá)的的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，以期進(jìn)行相關(guān)的表型觀察與功能研究，但并未在預(yù)期的位置檢測到Igsf1的過表達(dá)。
　　綜上，我們提供了充分的證據(jù)，從遺傳學(xué)層面說明Xq26.1上的微重復(fù)很可能是BDCS的致病突變，但其具體致病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　第三部分常染色體顯性遺傳性稀毛癥致病突變鑒定
　　遺傳性稀

9、毛癥（hereditary hypotrichosis，HH）是一組臨床上較少見的疾病，既可單獨(dú)發(fā)生，也可合并其他表型發(fā)生?；颊咄ǔ３錾鷷r有頭發(fā)，幾個月后開始脫落，具有很強(qiáng)的臨床表型異質(zhì)性，可為全身受累(generalized)或頭皮受累(scalp-limited)，伴有或不伴有毛干異常，以及毛囊發(fā)育異常等。同時，該病也具很強(qiáng)的遺傳異質(zhì)性，主要為常染色體顯性(autosomal dominant，AD)與常染色體隱性(autosoma

10、l recessive，AR)。致病基因已知的ADHH按表型可分為三大類，第一類為單純性遺傳性稀毛癥（hereditary hypotrichosis simplex，HSS），其中全身受累型的致病基因APCDD1、RPL21和SNRPE，頭皮受累型為CDSN;第二類為Marie Unna型遺傳性稀毛癥(MarieUnna hereditary hypotrichosis，MUHH)，其中1型的致病基因?yàn)閁2HR，2型為EPS8L3;第

11、三類位羊毛狀發(fā)(woolly hair，WH)，致病基因?yàn)镵RT74及KRT71。本研究收集三個ADHH家系(F1、F2、F3)，分別對其進(jìn)行基因診斷與相關(guān)遺傳學(xué)研究。
　　在F1中，我們通過等位基因共享分析排除APCDD1、RPL21、CDSN、SNRPE，以及兩個KRT基因簇中的基因作為該家系的致病基因，最終在U2HR基因中檢測到c.82G＞C(D28H)雜合突變作為致病突變，可為該家系后續(xù)的遺傳咨詢及產(chǎn)前基因診斷提供基礎(chǔ)。<

12、br>　　在F2中，我們首先確認(rèn)了患病的父親攜帶U2HR基因c.2T＞C(M1T)雜合突變;隨后胎兒經(jīng)Sanger測序并排除母源污染，確認(rèn)不攜帶此突變，不為患者。
　　在F3中，我們先對先證者進(jìn)行APCDD1和RPL21基因突變篩查，檢測到RPL21基因c.95G＞A(R32Q)雜合突變，并在全部家系成員中驗(yàn)證，確認(rèn)為致病突變。隨后，通過與報(bào)道了相同突變的F4和F5共同進(jìn)行單體型分析，確認(rèn)三家突變?yōu)楠?dú)立發(fā)生，從而進(jìn)一步確認(rèn)RPL2