干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響.pdf

1、背景與目的：
　　microRNAs是一類高度保守的、非編碼內(nèi)源性小RNA分子，對機(jī)體正常的生長發(fā)育及疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。Let-7家族成員對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分化起著重要的作用，了解微小RNA let-7d對MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響可以促進(jìn)顱內(nèi)干細(xì)胞移植的發(fā)展。本文通過體外構(gòu)建let-7d慢病毒載體并轉(zhuǎn)染MSCs來探討let-7d在MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中的作用。
　　方法：
　　1.構(gòu)

2、建大鼠慢病毒載體，分別為轉(zhuǎn)染空白慢病毒、轉(zhuǎn)染let-7d目的基因，轉(zhuǎn)染抑制let-7d表達(dá)的目的基因，并用這些慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠MSCs；根據(jù)轉(zhuǎn)染的慢病毒載體的不同，實(shí)驗(yàn)分為4個組：即轉(zhuǎn)染上調(diào)組(轉(zhuǎn)染let-7d-LV)、轉(zhuǎn)染下調(diào)組(轉(zhuǎn)染let-7d-inhibition-LV)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染空白慢病毒)、未轉(zhuǎn)染組。
　　2.MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的存活率。
　　3.采用法舒地爾誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的各組MSCs促使其分化為神經(jīng)細(xì)

3、胞，
　　4.以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測分化后細(xì)胞表面NSE、MAP-2的表達(dá)變化，以確定MSCs已分化為神經(jīng)細(xì)胞；
　　5.應(yīng)用RT-PCR、Western bolt法檢測分化后神經(jīng)細(xì)胞MAP-2 mRNA的表達(dá)量，以確定MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的效率；
　　結(jié)果：
　　1.在倒置熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染的MSCs有熒光顯示，提示let-7d慢病毒載體轉(zhuǎn)染成功。各組之間細(xì)胞的熒光強(qiáng)度無明顯差異，提示不同組別之間細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

4、效率無明顯差異。
　　2.MTT法檢測細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染上調(diào)組、轉(zhuǎn)染下調(diào)組及陰性轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率之間無顯著差異(P＞0.05)，但此三組細(xì)胞存活率均低于未轉(zhuǎn)染組。
　　3.在轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞之間加入法舒地爾，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，免疫細(xì)胞化學(xué)法發(fā)現(xiàn)高表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物NSE、MAP-2，表明法舒地爾可以誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。
　　4.免疫細(xì)胞化學(xué)法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染上調(diào)組細(xì)胞的NSE、MAP-2的熒光強(qiáng)度高于陰性對照組和

5、轉(zhuǎn)染下調(diào)組(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染下調(diào)組細(xì)胞的NSE、MAP-2的熒光強(qiáng)度低于陰性對照組和轉(zhuǎn)染下調(diào)組(P＜0.05)。
　　5.RT-PCR法檢測MAP-2 mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染上調(diào)組細(xì)胞的MAP-2表達(dá)量高于陰性對照組和轉(zhuǎn)染下調(diào)組(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染下調(diào)組細(xì)胞的MAP-2表達(dá)量低于陰性對照組和轉(zhuǎn)染下調(diào)組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.let-7d慢病毒載體可以在體外轉(zhuǎn)染大鼠MSCs，并且可以用于實(shí)驗(yàn)研