CDC42過表達(dá)在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：膽管細(xì)胞癌是相對(duì)比較常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，近年來該腫瘤診斷、發(fā)現(xiàn)率不斷提高，特別是肝外膽管細(xì)胞癌提高最為明顯。作為消化道的實(shí)體性惡性腫瘤，其典型的生物學(xué)表現(xiàn)主要是原位膨脹及浸潤生長，侵襲轉(zhuǎn)移是其主要的致死原因，外科干預(yù)性治療是目前主要的治療方式，但不能保證膽管癌的遠(yuǎn)處、淋巴結(jié)及微小轉(zhuǎn)移灶的徹底根除，術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移難以避免，此情況嚴(yán)重制約了膽管癌的手術(shù)切除效果及預(yù)后評(píng)估，通過對(duì)膽管細(xì)胞癌的深入認(rèn)識(shí)，可

2、以針對(duì)膽管癌患者提出一個(gè)綜合性的治療方案，并根據(jù)患者的具體病理特點(diǎn)來判斷預(yù)后，而這些都需要技術(shù)和理論的支持。
　　前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，67 LR蛋白過表達(dá)的膽管癌細(xì)胞株（QBC939、RBE）其突觸形成明顯多于正常的膽管上皮細(xì)胞，且在mRNA水平其表達(dá)水平亦明顯增高。67 LR是一種非整合素受體，多表達(dá)于消化道上皮細(xì)胞表面，一些研究表明其參與細(xì)胞與基底膜以及細(xì)胞外基質(zhì)的粘附功能。另外研究表明多種組織的惡性腫瘤中67LR表達(dá)增高，并

3、通過多種機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞癌中67LR過表達(dá)，顯著促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲。猜想在67LR高表達(dá)細(xì)胞株中出現(xiàn)的突觸形成增多，是否為67LR過表達(dá)促進(jìn)了突觸形成或啟動(dòng)，直接或間接的激活了突觸形成的信號(hào)分子。
　　在腫瘤細(xì)胞中，突觸形成是與Rho GTP酶密切相關(guān)的。RHO GTP酶是一類Ras相關(guān)的信號(hào)分子，在腫瘤中可出現(xiàn)異常的激活或抑制。Rho GTP酶可以將 GDP偶聯(lián)去活化為GTP形式，活性形式可以結(jié)

4、合一定數(shù)量的效應(yīng)分子，信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，從而調(diào)控各種細(xì)胞過程。Rho其家族成員主要包括有RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac4、Cdc42等多個(gè)分子，該族成員分子為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)中間參與分子，例如 RhoA誘導(dǎo)張力纖維的形成，Racl誘導(dǎo)細(xì)胞板狀偽足和細(xì)胞膜皺壁的形成，Cdc42是Rho家族蛋白(RhoGTPase)中的重要成員之一，主要參與細(xì)胞侵襲足的形成等，并可通過參與激活下游的信號(hào)分子及效應(yīng)分子產(chǎn)生一系列的生物學(xué)

5、反應(yīng)，從而調(diào)控細(xì)胞的骨架重構(gòu)及細(xì)胞極性的變化。近年研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族分子與不同的組織來源所起到的作用不同，在某些惡性腫瘤的（乳腺癌、頭頸部腫瘤等）出現(xiàn)Cdc42的高表達(dá)情況，而在某些肝臟病變及血液系統(tǒng)腫瘤中出現(xiàn)Cdc42低表達(dá)的表型。將針對(duì)67LR過表達(dá)的出現(xiàn)的體外細(xì)胞株突觸（侵襲足）增多情況，研究Cdc42在膽管細(xì)胞癌中表達(dá)模式情況如何。67LR過表達(dá)是否通過影響Cdc42，進(jìn)而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　目的：應(yīng)用免疫組織

6、化學(xué)（IHC）、Real-Time PCR、免疫熒光、WesternBlot方法從組織蛋白和mRNA水平檢測(cè)Cdc42蛋白的表達(dá)水平，探討在臨床上明確診斷的膽管細(xì)胞癌中 Cdc42的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性以及Cdc42在膽管癌患者預(yù)后評(píng)估中的作用和意義。并研究67LR過表達(dá)調(diào)控Cdc42影響膽管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　材料方法：
　　1.根據(jù)免疫組化染色的陽性細(xì)胞數(shù)目以及染色強(qiáng)度對(duì) Cdc42的表達(dá)量進(jìn)

7、行半定量分析，采用免疫組化染色的方法對(duì)87例膽管癌標(biāo)本、23例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和18例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本（2005-2010行膽管癌手術(shù)治療患者標(biāo)本），并對(duì)比淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中Cdc42的表達(dá)差異。
　　2. Cdc42蛋白表達(dá)量與膽管癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，Cdc42表達(dá)量與膽管癌患者生存率的相關(guān)性采用Kaplan-Meier法分析并用log-rank檢測(cè)；采用Cox多元線性回歸分析所有涉及的臨床病理指標(biāo)，評(píng)估其對(duì)膽管癌

8、患者總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間的影響。
　　3.構(gòu)建 Cdc42干擾和過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞株(QBC939和 RBE)，干預(yù)Cdc42表達(dá)；通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，研究Cdc42對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.采用免疫組化觀察87例膽管癌組織中67LR的表達(dá)情況，分析67LR和Cdc42表達(dá)的相關(guān)性。構(gòu)建67LR干擾和過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞(QBC939和RBE)；通過real-t

9、ime PCR、western-blot實(shí)驗(yàn)，研究膽管癌細(xì)胞中干預(yù)67LR表達(dá)對(duì)Cdc42表達(dá)的影響；采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)，研究膽管癌細(xì)胞中 Cdc42能否與67LR基因啟動(dòng)子結(jié)合。通過 western-blot實(shí)驗(yàn)，研究膽管癌細(xì)胞中干預(yù)67LR表達(dá)對(duì)活性Cdc42表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.明確診斷的膽管癌切除組織標(biāo)本中（87例），34例癌組織(39％)呈現(xiàn)Cdc42胞漿染色陽性；而24例癌旁組織

10、Cdc42有4例呈陽性（17%），而其余染色陰性；提示膽管癌中存在 Cdc42異常高表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析 Cdc42表達(dá)與患者臨床病理特性相關(guān)性提示：Cdc42陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而與患者性別、年齡、原發(fā)灶TNM分級(jí)、組織分化程度無關(guān)。32例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，25例（78%）出現(xiàn) Cdc42染色陽性，陽性率顯著高于原發(fā)灶（39%）；18例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶中，13例（75%）呈Cdc42染色陽性，其陽性率也高于原發(fā)灶；這些

11、結(jié)果提示：膽管癌中Cdc42異常表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2. Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示：Cdc42陽性表達(dá)的患者術(shù)后總存活時(shí)間顯著低于Cdc42陰性組患者；而其腫瘤復(fù)發(fā)顯著早于Cdc42陰性表達(dá)的患者。Cox模型分析提示：Cdc42異常表達(dá)是判斷病人術(shù)后存活時(shí)間和腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間的相對(duì)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本部分結(jié)果提示：Cdc42異常表達(dá)可能是判斷膽管患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志。
　　3.利用體外膽管癌細(xì)胞株（QBC93

12、9、RBE）免疫熒光檢測(cè)，觀察 Cdc42在兩株細(xì)胞間的差異，并通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，得出 QBC939細(xì)胞株中干擾Cdc42表達(dá)顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力；而RBE細(xì)胞株中過表達(dá)Cdc42明顯增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。本部分實(shí)驗(yàn)提示：Cdc42過表達(dá)可能促進(jìn)膽管癌細(xì)侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.明確診斷的膽管癌切除組織標(biāo)本中（87例），35例(40%)呈現(xiàn)67LR膜染色陽性?？ǚ綑z驗(yàn)提示67LR表達(dá)與Cdc42表

13、達(dá)情況顯著相關(guān)。連續(xù)切片免疫組化發(fā)現(xiàn)：67LR和Cdc42在膽管癌組織的表達(dá)具有相對(duì)的一致性。
　　5.在體外膽管癌細(xì)胞株（QBC939）中干擾67LR的表達(dá)，Cdc42的mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化。在膽管癌細(xì)胞株（RBE）中上調(diào)67LR的表達(dá)，Cdc42的 mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示QBC939和 RBE細(xì)胞中 Cdc42與67LR基因啟動(dòng)子區(qū)無結(jié)合。通過western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)QBC939中干

14、擾67LR的表達(dá)，活性Cdc42的表達(dá)降低，RBE中上調(diào)67LR表達(dá)，活性Cdc42的表達(dá)增強(qiáng)。本部分結(jié)果提示膽管癌細(xì)胞株體外體外實(shí)驗(yàn)中，67LR可能通過增強(qiáng) Cdc42的活性形式的促進(jìn)膽管癌的侵襲作用。
　　結(jié)論：
　　1.利用IHC、western blot、以及PCR等分子生物學(xué)研究手段發(fā)現(xiàn)Cdc42在膽管細(xì)胞癌中存在異常高表達(dá)。
　　2. Cdc42表達(dá)量與腫瘤的淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相關(guān)性；并與膽