鼠抗人CD40突變體分子的單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、CD40為CD40L的受體，是相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為48000的I型跨膜糖蛋白，屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)/腫瘤壞死因子受體(TNFK)超家族成員。CD40主要表達(dá)于B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞(如急慢性淋巴細(xì)胞白血病，霍奇金淋巴瘤，鼻咽癌，乳腺癌等)也有表達(dá)。CD40/CD40L是免疫細(xì)胞間重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在B細(xì)胞的活化與增殖分化、抗體產(chǎn)生及同種類型轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用，在T

2、細(xì)胞活化以及效應(yīng)性細(xì)胞因子的分泌過(guò)程中也起重要調(diào)節(jié)作用。CD40分子介導(dǎo)的信號(hào)不僅能對(duì)CD40+腫瘤細(xì)胞直接發(fā)揮作用，還可通過(guò)調(diào)節(jié)適應(yīng)性和固有免疫系統(tǒng)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)表達(dá)CD40分子的腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。目前國(guó)際上已有三株人源化抗人CD40單抗進(jìn)入臨床III期，但其存在的副作用和安全性問(wèn)題仍引起高度關(guān)注。本科室以往的研究發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞株和新鮮腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD40突變體(CD40mu)(CAC→CAA,78His→78Gln)(NCBI As

3、say Id：ss23134804，Reference SNP Id：rs17177493)，該突變位點(diǎn)位于CD40胞外段第二個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，這一區(qū)域是CD40與CD40L相互作用的重要區(qū)域?；蜣D(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建進(jìn)一步證實(shí)了該突變體與抗體的結(jié)合能力與野生型CD40截然不同，CD40mu胞外段一個(gè)氨基酸的突變可導(dǎo)致局部結(jié)構(gòu)改變而形成新的抗原表位，該抗原表位為CD40mu所特有，為此，研制特異性抗人CD40mu分子的單克隆抗體，具備重要

4、的研發(fā)價(jià)值。本文研制的mAb3FA、684與10C5是鼠抗人CD40mu單克隆抗體，完全不同于已報(bào)道的抗人CD40單克隆抗體，能識(shí)別多種腫瘤細(xì)胞株(H08910,H460等)以及腫瘤新鮮組織表達(dá)的CD40分子，其中10C5不識(shí)別血管內(nèi)皮細(xì)胞株Eahy926以及一些正常組織表達(dá)的CD40分子，顯示出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。 1.鼠抗人CD40mu單抗的雜交瘤細(xì)胞株的制備 以突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD40mu為免疫原，免疫BA

5、LB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞融合技術(shù)，將反復(fù)免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨銹瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，以突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD40mu為陽(yáng)性篩選細(xì)胞，以野生型CD40基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD40wt為陰性篩選細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光標(biāo)記法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得3株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CD40mu單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E4、684和10C5，其重鏈分別為IgG2b、IgG1、IgG3，輕

6、鏈為κ鏈。三株抗體均可用于免疫組織化學(xué)分析，3E4和10C5可用于Western-blot檢測(cè)。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長(zhǎng)良好，穩(wěn)定分泌抗體。 2.鼠抗人CD40mu單克隆抗體的體外生物學(xué)特性研究 運(yùn)用制備的單抗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，部分惡性B細(xì)胞株及上皮性腫瘤細(xì)胞株表達(dá)CD40mu，其在新鮮腫瘤組織中也有高水平的表達(dá)。三株單抗與野生型CD40單抗5C11識(shí)別的抗原位點(diǎn)不同，對(duì)細(xì)胞株的識(shí)別譜

7、也不相同。不同于已報(bào)道的抗人CD40單克隆抗體，三株單抗能識(shí)別多種腫瘤細(xì)胞株(H08910,H460等)以及腫瘤新鮮組織表達(dá)的CD40分子，其中10C5不識(shí)別血管內(nèi)皮細(xì)胞株Eahy926以及一些正常組織表達(dá)的CD40分子。繼而采用抗CD40mu單抗對(duì)表達(dá)CD40mu的人卵巢癌細(xì)胞株H08910的體外實(shí)驗(yàn)初步表明，單抗3E4能夠促進(jìn)HO8910細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，單抗10C5能夠抑制HO8910細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，并且促使其凋亡。 綜上所