蝗蟲精氨酸激酶基因的克隆、表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)(ATP:Arginine N-phosphotransferase EC 2.7.3.3)屬于磷酸原激酶家族中的重要一員，廣泛的存在于無脊椎動(dòng)物及軟體動(dòng)物中，起著類似于脊椎動(dòng)物中肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)(ATP:Creatine N-phosphotransferase EC 2.7.3.2)的作用，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激

2、酶。磷酸原激酶家族是一個(gè)保守家族，可逆催化肌酸或精氨酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)，形成的高能磷酸化的磷酸肌酸或磷酸精氨酸稱為磷酸原。本研究對(duì)蝗蟲精氨酸激酶進(jìn)行了克隆、表達(dá)以及分離純化，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了精氨酸激酶的基本酶學(xué)性質(zhì)、酶的催化機(jī)制、底物結(jié)合協(xié)同性、點(diǎn)突變對(duì)其活性、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響、酶的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制以及抑制劑的抑制機(jī)理，旨在為開發(fā)以精氨酸激酶為靶標(biāo)的新型害蟲抑制劑提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)的主要結(jié)果如下： 1.精氨酸

3、激酶基因的克隆利用同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過RT-PCR的方法從蝗蟲腿肌中克隆到精氨酸激酶基因的中間片段，通過5’-RACE和3’-RACE分別克隆到5’和3’片段，拼接后設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增到全長(zhǎng)cDNA，命名為L(zhǎng)mmAK(DQ513322)。該基因全長(zhǎng)為2014 bp，ORF為1068bp，編碼355個(gè)氨基酸，分子量約為40 kD。同源性分析表明LmmAK有兩個(gè)序列保守的結(jié)構(gòu)域，其中第一個(gè)結(jié)構(gòu)域，即GS結(jié)構(gòu)域是與底物結(jié)合協(xié)同性有關(guān)的氨基

4、酸，研究表明Y75和P272在底物結(jié)合協(xié)同性方面起關(guān)鍵作用。第二個(gè)結(jié)構(gòu)域，即磷酸源激酶的保守結(jié)構(gòu)域包括“C-P-(S/T)-N-(I/L)-G-T”等保守的氨基酸。 2.精氨酸激酶的表達(dá)和分離純化將精氨酸激酶的基因連接到原核表達(dá)載體pET-30a和pET-28a上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。當(dāng)用原核表達(dá)載體pET-30a進(jìn)行表達(dá)時(shí)，得到包涵體形式存在的精氨酸激酶，通過變性復(fù)性的方法可以得到活性的精氨酸激酶，在變性復(fù)性體系中加

5、入小分子物質(zhì)SDS和Tween能提高蛋白質(zhì)復(fù)性的效率。當(dāng)用pET-28a進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，通過改變誘導(dǎo)條件得到了以可溶性形式存在的有功能的精氨酸激酶，通過改進(jìn)的純化方法和Sephadex G-75排阻層析方法相結(jié)合可以純化得到精氨酸激酶，最終的回收率為90％。 3.重組精氨酸激酶的酶學(xué)性質(zhì)通過包涵體變性復(fù)性方法獲得的精氨酸激酶和通過活性形式分離純化得到的精氨酸激酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與從蝗蟲腿肌中直接分離得到的酶的參數(shù)相同。這些參數(shù)包括

6、底物的分離常數(shù)、米氏常數(shù)、酶的比活力、酶的泳動(dòng)性和酶的等電點(diǎn)等。通過與來源于蟑螂、海蟹的精氨酸激酶的參數(shù)的比較我們發(fā)現(xiàn)蝗蟲的精氨酸激酶具有最高的底物親和力和較強(qiáng)的底物結(jié)合協(xié)同性。 4.精氨酸激酶的底物結(jié)合協(xié)同性有關(guān)的氨基酸通過定點(diǎn)突變的方法獲得一系列精氨酸激酶的突變體來研究與底物結(jié)合協(xié)同性有關(guān)的的氨基酸位點(diǎn)。突變體Y75F和Y75D表現(xiàn)較強(qiáng)的底物結(jié)合協(xié)同性(Kd/Km=6.2-13.4)，然而單突變P272G和P272R以及雙

7、突變Y75F/P272G的底物結(jié)合協(xié)同性幾乎完全喪失(Kd/Km=1.1-1.4)，另一個(gè)雙突變體Y75D/P272R具有與野生型酶的相同的酶學(xué)性質(zhì)。所有的結(jié)果表明75位和272位的氨基酸在精氨酸激酶的底物結(jié)合協(xié)同性方面起關(guān)鍵的作用。光譜學(xué)和酶動(dòng)力學(xué)研究的結(jié)果為底物結(jié)合協(xié)同性的改變與酶空間結(jié)構(gòu)存在微妙的關(guān)系提供了一個(gè)直接的證據(jù)。 5.脯氨酸(P272)對(duì)精氨酸激酶的活性、空間結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的影響脯氨酸(P272)位點(diǎn)雖不位于酶的

8、活性中心部位，但是它在維持酶的穩(wěn)定性和酶的活性方面起重要作用。該位點(diǎn)的突變引起酶的空間結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致酶形成部分折疊的、具有活性的和有更多疏水區(qū)暴露酶，這種酶在高溫等極端環(huán)境中易于聚沉而沉淀。該位點(diǎn)的突變影響了酶從熔球態(tài)中間體向活性酶的折疊過程。以上結(jié)果說明某些靠近活性中心的氨基酸可能在維持酶的正確的空間結(jié)構(gòu)和保持酶的活性方面起關(guān)鍵作用。 6.精氨酸激酶的表達(dá)調(diào)控模式對(duì)蝗蟲生長(zhǎng)過程中精氨酸激酶的蛋白含量、酶的比活力和mRNA的含