尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在A549細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、研究背景:
　　尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltrans ferase，NAMPT），是哺乳動物細(xì)胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)補(bǔ)救合成途徑的限速酶，而NAD是細(xì)胞物質(zhì)能量代謝的重要輔酶。研究發(fā)現(xiàn)，NAMPT與腫瘤的關(guān)系非常密切，相比于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞對物質(zhì)、能量的需求更高，因而對NAMPT的需求也更高。臨床研

2、究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤患者血清中的NAMPT水平顯著升高，且隨著腫瘤惡性程度的加深而增加，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。有研究者認(rèn)為可以將患者血清中的NAMPT水平作為評估腫瘤惡性程度的生物標(biāo)記物。還有研究發(fā)現(xiàn)，NAMPT能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及管腔形成，通過誘導(dǎo)ERK通路（Extracellular regulated protein kinase，ERK）和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMP2/9)的活化，

3、促進(jìn)血管增生，因而認(rèn)為NAMPT對于腫瘤細(xì)胞的遷移有促進(jìn)作用，這提示NAMPT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系。目前，NAMPT特異性抑制劑FK866已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，F(xiàn)K866能通過特異性抑制NAMPT酶活性，使NAD的合成減少，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。研究者認(rèn)為，F(xiàn)K866是極具應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。
　　腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移與多種因素有關(guān)，在惡性腫瘤的發(fā)展過程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Tr

4、ansition，EMT）是腫瘤發(fā)生侵襲和向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要步驟。然而，NAMPT及其抑制劑FK866對腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是否有影響，卻少有研究報(bào)道。本研究中，我們應(yīng)用FK866抑制細(xì)胞NAMPT酶活性、細(xì)胞外直接給予NAMPT蛋白作處理因素，觀察這些處理對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞發(fā)生EMT的影響，并初步探討這些處理影響A549細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制。
　　研究目的:
　　觀察尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)抑制

5、劑FK866及細(xì)胞外NAMPT在A549細(xì)胞發(fā)生EMT中的作用，并初步探討以上處理影響A549細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.探討抑制NAMPT酶活性對A549細(xì)胞發(fā)生EMT影響:
　　(1)使用TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT，建立EMT模型;采用RT-qPCR方法檢測FK866處理后，模型表達(dá)與EMT相關(guān)分子標(biāo)記物E-cadherin、vimentin和α-SMA的mRNA的情況;
　　

6、(2)采用RT-qPCR方法檢測A549細(xì)胞以FK866不同濃度不同時(shí)間作用后，表達(dá)EMT相關(guān)分子標(biāo)記物E-cadherin、vimentin和α-SMA的mRNA的情況;
　　(3)以RT-qPCR方法檢測FK866作用后A549細(xì)胞的TGF-β1表達(dá);
　　(4)以NAMPT的底物NMN（模擬NAMPT酶活性增高）預(yù)處理A549細(xì)胞后，再以FK866給藥處理，觀察NMN能否逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT相關(guān)分子的表達(dá)變化;<

7、br>　　(5)以Western blotting檢測FK866處理A549細(xì)胞不同時(shí)間，細(xì)胞ERK1/2及p-ERK1/2的表達(dá);并使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理，以進(jìn)一步確證ERK通路激活參與調(diào)控FK866引起的A549細(xì)胞發(fā)生EMT;
　　(6)以RT-qPCR方法檢測FK866作用后A549細(xì)胞中EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Slug，Twist的表達(dá);
　　2.探討細(xì)胞外NAMPT對A549細(xì)胞發(fā)生EMT的影響:<

8、br>　　(1)以基因重組的人NAMPT野生型蛋白、酶活性位點(diǎn)突變型蛋白(NAMPT/H247A)處理A549細(xì)胞，以TGF-β1為陽性對照，采用RT-qPCR檢測細(xì)胞上皮化標(biāo)記物E-cadherin，間質(zhì)化標(biāo)記物vimentin和α-SMA的表達(dá)。
　　(2)使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理后，檢測上皮化標(biāo)記物E-cadherin，間質(zhì)化標(biāo)記物vimentin和α-SMA的表達(dá)情況。
　　(3)以基因重組的人NAMPT蛋白

9、野生型、酶活性位點(diǎn)突變型蛋白NAMPT/H247A（500 ng/ml）處理A549細(xì)胞，采用RT-qPCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Slug，Twist的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　1.抑制NAMPT酶活性可促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生EMT
　　(1) TGF-β1濃度依賴和時(shí)間依賴的誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT; FK866預(yù)處理并未能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT;
　　(2)單獨(dú)使用FK866處理A549細(xì)胞后

10、，細(xì)胞間質(zhì)化標(biāo)記物vimentin與α-SMA的mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性的顯著升高;
　　(3) FK86610 nM單獨(dú)使用處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞表達(dá)TGF-β1明顯下降，表明較高濃度的FK866誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT其機(jī)制可能不涉及TGF-β1的上調(diào)表達(dá);
　　(4)NMN能夠顯著逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化，提示FK866促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制涉及其對NAMPT酶活性的抑制;
　　(5)隨著FK

11、866作用時(shí)間的延長，細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)顯著增加，且U0126預(yù)處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT標(biāo)記物vimentin和α-SMA的mRNA表達(dá)上調(diào);提示FK866促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制涉及ERK通路激活;
　　(6) FK866(1nM)處理A549細(xì)胞72 h，可顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Slug，Twist的表達(dá)，提示FK866促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制涉及EMT相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。
　　2.細(xì)胞

12、外NAMPT(eNAMPT)可促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生EMT
　　(1)人基因重組的NAMPT蛋白野生型(500 ng/ml)和酶活性位點(diǎn)突變型蛋白NAMPT/H247A(500 ng/ml)處理均可引起A549細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-cadherin的mRNA的表達(dá)顯著下降，間質(zhì)化標(biāo)記物vimentin的mRNA的表達(dá)顯著增加;
　　(2) ERK抑制劑U0126預(yù)處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)eNAMPT引起的E-cadherin和viment

13、in的mRNA表達(dá)變化;
　　(3)人基因重組的NAMPT蛋白野生型及酶活性位點(diǎn)突變型蛋白(NAMPT/H247A)(500 ng/ml)處理細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄因子Snail，Slug，Twist的表達(dá)均顯著增加。
　　結(jié)論:
　　1.NAMPT酶活性抑制劑FK866可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT，其作用機(jī)制涉及對NAMPT酶活性抑制、ERK通路激活以及EMT相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。
　　2.細(xì)胞外較高濃度的NAMPT也