DRG神經(jīng)元T型鈣通道調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、T型鈣通道又稱低電壓激活鈣通道(LVA)，其組織分布廣泛，并且在機(jī)體生理和病理過程中，如神經(jīng)放電、疼痛、癌癥等都發(fā)揮重要的作用。因此，研究T型鈣通道調(diào)節(jié)機(jī)制有重要意義。
　　然而，由于T型鈣通道特異性抑制劑的缺乏，致使T型鈣通道調(diào)節(jié)機(jī)制研究受限，發(fā)展緩慢。大量研究表明，許多激素和神經(jīng)遞質(zhì)都可通過激活G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）來調(diào)控T型鈣通道，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚。
　　因此，本研究將圍繞激活GPCRs來探索T型鈣通

2、道的調(diào)節(jié)機(jī)制。此外，還將研究硫化氫氣體對DRG神經(jīng)元中T型鈣電流的調(diào)節(jié)作用。
　　第一部分 G蛋白偶聯(lián)受體對DRG神經(jīng)元T型鈣通道的調(diào)節(jié)及分子機(jī)制的研究
　　目的:研究激活GPCRs對T型鈣通道的作用并初步探索其調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。包括:(1)μ型阿片受體激動(dòng)劑DAMGO對DRG神經(jīng)元中T型鈣電流的調(diào)節(jié)作用。(2) GABAB受體激動(dòng)劑baclofen對DRG神經(jīng)元中T型鈣電流及過表達(dá)在HEK293細(xì)胞中Cav3.2電流的調(diào)節(jié)作

3、用。(3)研究baclofen調(diào)節(jié)T型鈣通道的分子機(jī)制。
　　方法:利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)行研究。
　　結(jié)果:
　　(1)μ型阿片受體激動(dòng)劑DAMGO(250 nM)可逆性抑制DRG神經(jīng)元中T型(LVA)和高電壓激活鈣通道(HVA)鈣電流，抑制率分別為41.8±10.4％(n=3)和65.8±6.7％(n=8)。
　　(2) DAMGO對HVA鈣電流的抑制作用成濃度依賴性(EC50=17.72±6.9 nM)，并

4、且G蛋白βγ亞基一定程度上參與了此抑制過程。
　　(3)在一些DRG細(xì)胞中，DAMGO并不能夠抑制T型鈣電流。
　　(4) GABAB受體激動(dòng)劑baclofen可逆性抑制DRG神經(jīng)元中LVA(T型)和HVA鈣電流，抑制率分別為22.53±2.05％(n=15)、31.90±3.11％(n=27)。并且此抑制作用可被400 ng/ml PTX部分阻斷(P＜0.001，n=9～11)。
　　(5)GDP-beta-s能夠部

5、分阻斷baclofen對HVA鈣電流的抑制作用(P＜0.05，n=16)，但不能阻斷baclofen對LVA鈣電流的抑制作用(P＞0.05，n=6)。
　　(6) DTT能夠部分恢復(fù)baclofen對LVA(T型)鈣電流的抑制作用(P＜0.01，n=6)，但對baclofen引發(fā)的HVA鈣電流的抑制作用沒有影響(P＞0.05，n=14)。
　　(7)GABAB受體激動(dòng)劑baclofen可逆性抑制與GABAB共表達(dá)在HEK29

6、3細(xì)胞中的Cav3.2電流，抑制率為24.73±1.11％(n=12)，并且此抑制作用可被1 mM DTT部分洗脫(P＜0.001，n=7)
　　結(jié)論:采用全細(xì)胞膜片鉗的方法發(fā)現(xiàn)激活μ型阿片受體和GABAB受體均可抑制T型鈣電流，但多數(shù)表達(dá)T型鈣通道的DRG神經(jīng)元并不表達(dá)μ受體。GABAB受體對T型鈣通道的調(diào)節(jié)是由Gαi/o型G蛋白介導(dǎo)的，并且還涉及氧化還原調(diào)節(jié)途徑。
　　第二部分硫化氫對DRG神經(jīng)元T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用

7、r>　　目的:觀察硫化氫對DRG神經(jīng)元上T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用
　　方法:利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)行研究。
　　結(jié)果:
　　(1)NaHS在低濃度時(shí)能夠選擇性抑制DRG神經(jīng)元上的T型鈣電流，并且在100μM(n=5)、300μM(n=6)、1mM(n=6)三個(gè)濃度梯度時(shí)，對T型鈣電流的抑制率成濃度依賴性。NaHS對HVA鈣電流沒有作用(P＞0.05，n=11)。
　　(2)NaHS在高濃度時(shí)(3mM，10mM)增大T

8、型鈣電流。
　　(3)高濃度NaHS對T型鈣電流的增大作用主要是Na+引起，而不是H2S本身的作用。將10 mM NaHS替換成10 mM NaCl時(shí)，后者同樣能夠增大T型鈣電流，雖然10 mM NaCl的增大作用似乎略小與10 mMNaHS的增大作用（P=0.07，n=5）。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2S能夠抑制DRG神經(jīng)元上的T型鈣電流，并且在較低濃度范圍內(nèi)抑制率呈濃度依賴性。高濃度的NaHS對T型鈣電流有增大作用，