人水離子通道蛋白4的表達(dá)及在視神經(jīng)脊髓炎診斷中的應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica,NMO）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central
　　nervous system,CNS)的嚴(yán)重性脫髓鞘疾病，主要損傷視神經(jīng)和脊髓，多起病急驟且進(jìn)展迅速，嚴(yán)重危害人類的健康。自1894年NMO這一概念被提出以來(lái)，對(duì)于NMO是一獨(dú)立的疾病還是多發(fā)性硬化(mutiple sclerosis,MS)的亞型一直存在較大的爭(zhēng)議。2004年Lennon等發(fā)現(xiàn)抗水離子通道蛋白4(

2、aquaporin-4,AQP4)抗體是NMO的特異性致病抗體，從而證明了NMO是不同于MS的一種體液免疫介導(dǎo)的自身免疫性疾病。由于NMO和MS的治療和預(yù)后存在較大的差異，因此，檢測(cè)疑似病例血清中的抗AQP4抗體水平對(duì)于NMO和MS的鑒別診斷、治療及預(yù)后判斷具有明顯的指導(dǎo)意義。迄今為止國(guó)內(nèi)尚缺乏靈敏度高和特異性強(qiáng)的試劑盒用于檢測(cè)AQP4抗體，建立一種適用于國(guó)人NMO中自身抗體的檢測(cè)方法是非常有必要的。目前已經(jīng)證明該抗體的主要結(jié)合位點(diǎn)是其

3、靶抗原AQP4的胞外區(qū)，克隆表達(dá)AQP4的胞外區(qū)有望為抗AQP4抗體的檢測(cè)提供原料。另外通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)AQP4全長(zhǎng)蛋白，比較原核表達(dá)胞外區(qū)蛋白和真核表達(dá)全長(zhǎng)蛋白在檢測(cè)AQP4抗體中的差異。
　　目的：
　　1.通過(guò)構(gòu)建pET32a(+)-AQP4的胞外區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)AQP4的胞外區(qū)蛋白，建立一種可用于檢測(cè)AQP4抗體的ELISA方法。
　　2.利用重組質(zhì)粒pCMV6-AC-GFP-AQP4轉(zhuǎn)染HEK293

4、細(xì)胞，表達(dá)AQP4全長(zhǎng)蛋白，建立用于檢測(cè)抗AQP4抗體的CBA方法。
　　方法：
　　1.利用生物信息學(xué)軟件TMHMM2.0分析人AQP4的結(jié)構(gòu)，并根據(jù)大腸桿菌的密碼子的偏好性設(shè)計(jì)合成AQP4胞外區(qū)的寡核苷酸序列。
　　2.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建pET32a(+)-AQP4胞外區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒。
　　3.構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，然后通過(guò)SDS-PAGE

5、電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。
　　4.大規(guī)模培養(yǎng)宿主菌并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，利用Ni2+離子親和層析技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化，目的蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳和Western blot的鑒定。
　　5.利用純化酶切的目的蛋白包被 ELISA微孔板，通過(guò)國(guó)際公認(rèn)檢測(cè)AQP4抗體的金標(biāo)準(zhǔn)間接免疫熒光法篩選的陽(yáng)性血清對(duì)表達(dá)蛋白的生物活性進(jìn)行評(píng)估。
　　6.通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒 pCMV6-AC-GFP-AQP4轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，

6、并同時(shí)用pCMV6-AC-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行固定后進(jìn)行后通過(guò)間接免疫熒光法檢測(cè)NMO患者患者血清中的抗體。
　　結(jié)果：
　　1.限制性內(nèi)切酶和測(cè)序分析均鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　2.經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定，構(gòu)建的pET-32a(+)-AQP4胞外區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白可以可溶性的表達(dá)形式在菌體的上清中表達(dá)，其相對(duì)分子量均在26KD左右。
　　3.誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白均可

7、經(jīng)過(guò)一步親和層析達(dá)到較高的純度。
　　4.誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白均可與抗His-tag的抗體進(jìn)行特異性的結(jié)合。
　　5.表達(dá)的AQP4的胞外區(qū)不能與抗AQP4抗體特異性結(jié)合。
　　6.轉(zhuǎn)染GFP空質(zhì)粒的細(xì)胞綠色熒光充滿整個(gè)細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染GFP-AQP4的細(xì)胞綠色熒光僅定位于細(xì)胞膜。
　　7.轉(zhuǎn)染GFP-AQP4的細(xì)胞能與NMO患者血清中的抗AQP4抗體特異性結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了pET-32a(