阿維A對銀屑病患者JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的:
　　1.運(yùn)用RNA干擾技術(shù)(RNAi)分別建立STAT1、STAT3低表達(dá)的角質(zhì)形成細(xì)胞，研究STAT1和STAT3的表達(dá)水平及其負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS1和SOCS3對銀屑病發(fā)病的影響。
　　2.探討阿維A對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響及對細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用，從而明確阿維A治療銀屑病的機(jī)制，并積極尋找治療銀屑病的新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.使用DMEM/10％FBS培養(yǎng)基于37℃、5％

2、 CO2培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。
　　2.分別用0.1uM、1uM、5uM濃度的阿維A處理HaCaT細(xì)胞。在孵育12h、24h、48h和72h后收集各組HaCaT細(xì)胞。利用MTS法檢測，根據(jù)OD值判斷不同濃度的阿維A處理后的HaCaT細(xì)胞的增殖情況，篩選出阿維A抑制HaCaT細(xì)胞增殖的適宜濃度和作用時(shí)間，觀察各時(shí)間段細(xì)胞增殖情況與阿維A是否呈劑量依賴關(guān)系。
　　3.檢測適宜濃度阿維A對HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT1、p-STAT1、

3、STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3表達(dá)的影響，使用Q-PCR和Western-blot方法檢測這些基因的表達(dá)水平。
　　4.構(gòu)建、轉(zhuǎn)染siRNA-STAT1與siRNA-STAT3:①在www.ncbi.nlm.nih.gov基因庫中搜索STAT1 mRNA和STAT3mRNA全基因序列，在BLAST軟件下進(jìn)行同源性分析。②根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，把對比好的STAT1mRNA與STAT3mRNA全基因序列作為模版

4、，分別設(shè)計(jì)三對siRNA-STAT1和siRNA-STAT3。三對siRNA-STAT1編號依次是: siRNA-STAT1-001、siRNA-STAT1-002、siRNA-STAT1-003;三對siRNA-STAT3編號依次是:siRNA-STAT3-001、siRNA-STAT3-002、siRNA-STAT3-003。③按照設(shè)計(jì)的序列分別合成三對siRNA，同時(shí)設(shè)立陰性對照組(NC-siRNA組)。④采用Lipo2000轉(zhuǎn)染

5、試劑將上述準(zhǔn)備好的siRNA序列按不同濃度分別轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞。
　　5.檢測沉默效果:利用Q-PCR和Western-blot技術(shù)檢測不同濃度和序列的siRNA對STAT1或STAT3mRNA與蛋白表達(dá)的影響，篩選分別針對STAT1和STAT3的最佳沉默序列。
　　6.擴(kuò)大培養(yǎng)成功導(dǎo)入最佳沉默序列的HaCaT細(xì)胞，分別通過Q-PCR、Western-blot和MTS法檢測沉默STAT1及STAT3基因后JAK/STAT信

6、號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)基因SOCS1與SOCS3表達(dá)情況以及其對HaCaT細(xì)胞增殖的影響。
　　7.藥物聯(lián)合干預(yù)導(dǎo)入si-RNA的細(xì)胞:上述篩選的最佳siRNA-STAT1和siRNA-STAT3序列，分別結(jié)合5uM濃度的阿維A處理細(xì)胞48h后，檢測STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平。
　　8.統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表

7、示，比較采用單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)水平為0.05。
　　結(jié)果:
　　1.分別以0.1uM、1uM、5uM濃度的阿維A處理HaCaT細(xì)胞株12h、24h、48h和72h后，用MTS法檢測不同時(shí)間和濃度阿維A對HaCaT細(xì)胞增殖影響，針對12h、24h、48h和72h的OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與空白對照組相比，阿維A可以抑制HaCaT細(xì)胞增殖，并且同一時(shí)間段內(nèi)的不同濃度阿維A抑制程度具有濃度依賴性（P均＜0.05），進(jìn)一步多重

8、比較顯示5uM阿維A的抑制作用最強(qiáng)，綜上所述，我們將采用5uM阿維A進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。檢測該濃度處理的HaCaT細(xì)胞內(nèi)STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均下降。
　　2.用免疫熒光法檢測siRNA的轉(zhuǎn)染情況，將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大量綠色熒光表明siRNA被有效轉(zhuǎn)染至HaCaT細(xì)胞。用Q-PCR和Western-blot法檢測STAT1和

9、STAT3的表達(dá)情況，證實(shí)STAT1和STAT3基因在HaCaT細(xì)胞內(nèi)被有效沉默。以上篩選出沉默效果最好的序列:50nMol/L siRNA-STAT1-003和50nMol/L siRNA-STAT3-001。
　　3.把上述沉默效果最好的siRNA-STAT1與siRNA-STAT3成功轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，聯(lián)合5uM阿維A處理。將細(xì)胞分為八個(gè)組:A:空白對照組;B.lipo2000組;C.NC-siRNA組;D.5uM阿維A組

10、;E.STAT1siRNA組;F.STAT3 siRNA組;G.STAT1 siRNA+5uM阿維A組;H.STAT3siRNA+5uM阿維A組。按上述處理八個(gè)組細(xì)胞后檢測HaCaT細(xì)胞增殖情況。將12h、24h、48h和72h后HaCaT細(xì)胞的OD值進(jìn)行方差分析，不同組的細(xì)胞增殖差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);進(jìn)一步兩兩對比發(fā)現(xiàn)各個(gè)時(shí)間段lip2000組、NC-siRNA組與空白細(xì)胞組相比無顯著差異(P＞0.05)，而阿維A組、 S

11、TAT1-siRNA組、STAT3-siRNA組、STAT1-siRNA+阿維A組、STAT3-siRNA+阿維A組與空白細(xì)胞組相比有顯著差異(P＜0.05)，表明HaCaT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染陰性對照干擾RNA、脂質(zhì)體lip2000對細(xì)胞增殖活性影響不大，對細(xì)胞增殖活性有抑制作用的因素是阿維A、STAT1-siRNA和STAT3-siRNA單獨(dú)或者協(xié)同作用的結(jié)果。孵育48、72h時(shí)阿維A組與STAT1-siRNA組、STAT3-siRNA組相比

12、有顯著差異(P＜0.05)，而STAT1-siRNA+阿維A、STAT3-siRNA+阿維A與單獨(dú)用STAT1-siRNA、STAT3-siRNA、阿維A相比也具有顯著差異(P＜0.05)。所有組的OD值從小到大為:STAT1-siRNA+阿維A組、STAT3-siRNA+阿維A組＜STAT1-siRNA組、STAT3-siRNA組＜阿維A組＜cells組、lip2000組、NC-siRNA。以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明阿維A、STAT1-siRN

13、A和STAT3-siRNA均能抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，并且兩者有協(xié)同作用，但阿維A的抑制作用弱于STAT1-siRNA和STAT3-siRNA。
　　4.八個(gè)組的STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3mRNA及蛋白相對含量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步比較結(jié)果顯示lipo2000、NC-siRNA組與空白對照組相比STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、SOC

14、S1、SOCS3mRNA及蛋白含量無顯著差異(P＞0.05)，說明脂質(zhì)體、陰性對照干擾RNA片段對HaCaT細(xì)胞內(nèi)的STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3的表達(dá)影響不大。對于STAT1 mRNA含量，STAT3-siRNA組與空白對照組相比無顯著差異，STAT1-siRNA+阿維A組、STAT3-siRNA+阿維A組、STAT1-siRNA組、阿維A組與空白對照組、lip2000組、NC-siRNA組相比，STAT1mRNA含量

15、顯著降低(P＜0.05)。對于STAT3mRNA含量，STAT1-siRNA組與空白對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，STAT1-siRNA+阿維A組、STAT3-siRNA+阿維A組、STAT3-siRNA組及阿維A組與空白對照組、lip2000組、NC-siRNA組相比STAT3mRNA含量顯著降低(P＜0.05)。而對于SOCS1、SOCS3mRNA相對表達(dá)量，阿維A組、STAT1-siRNA組、STAT3-siRNA組、ST

16、AT1-siRNA+阿維A組、STAT3-siRNA+阿維A組之間無明顯差異，但均低于空白對照組、lip2000組、NC-siRNA組。以上結(jié)果說明STAT1-siRNA均可抑制STAT1、SOCS1及SOCS3的表達(dá)，對STAT3抑制的作用不明顯;STAT3-siRNA可抑制STAT3、SOCS1、SOCS3的表達(dá)，但對STAT1的作用不明顯;而阿維A組則可以同時(shí)抑制STAT1、SOCS1、STAT3、SOCS3的表達(dá)。
　　結(jié)

17、論:
　　1.運(yùn)用阿維A處理HaCaT細(xì)胞株后，STAT1與STAT3及其負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS1和SOCS3的基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，并且HaCaT細(xì)胞增殖也受到抑制。進(jìn)一步運(yùn)用siRNA分別沉默STAT1與STAT3后，各組中STAT1或者STAT3及其負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS1、SOCS3的mRNA和蛋白含量減少，從而推測阿維A可能通過JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮治療銀屑病的臨床作用，即阿維A可能是通過下調(diào)STAT1和STAT3