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文檔簡介
1、本研究共分三部分
第一部分 IGF-Ⅰ對(duì)肝硬化大鼠腸粘膜屏障保護(hù)作用機(jī)制的研究
第二部分 IGF-Ⅰ對(duì)LPS損傷Caco-2細(xì)胞通透性影響及機(jī)制的研究
第三部分 肝硬化患者IGF-Ⅰ與肝功嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析
第一部分 IGF-Ⅰ對(duì)肝硬化大鼠腸粘膜屏障保護(hù)作用的研究
目的:
研究外源性補(bǔ)充IGF-Ⅰ對(duì)肝硬化大鼠腸緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達(dá)的調(diào)節(jié),研究I
2、GF-Ⅰ對(duì)肝硬化大鼠門脈中IGF-Ⅰ及內(nèi)毒素的影響,研究IGF-Ⅰ對(duì)肝硬化大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡的作用。探討研究外源性IGF-Ⅰ對(duì)肝硬化大鼠IB保護(hù)作用的機(jī)制。
方法:
1.將30只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及模型治療組。模型組腹腔內(nèi)注射四氯化碳(0.2ml/kg/d)6周誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型,對(duì)照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水(0.2ml/kg/d)6周。模型治療組腹腔內(nèi)注射四氯化碳(0.2
3、ml/kg/d)6周,后皮下注射重組人IGF-Ⅰ(0.2μg/kg/d)21天。
2.給藥結(jié)束后,禁食水24h,對(duì)三組大鼠進(jìn)行門靜脈壓力測(cè)定。留取門脈血液、肝組織及盲腸。
3.應(yīng)用試劑盒檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平。
4.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清IGF-Ⅰ水平
4、,采用鱟試驗(yàn)檢測(cè)血漿內(nèi)毒素水平。對(duì)肝組織進(jìn)行HE染色及Masson染色,觀察肝臟組織形態(tài),并應(yīng)用Image proplus軟件對(duì)肝纖維化進(jìn)行定量分析。
5.通過western blot及RT-PCR方法觀察大鼠盲腸中Occludin和Claudin-1蛋白及基因表達(dá)情況。
6.應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)盲腸細(xì)胞凋亡情況,并應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)盲腸凋亡基因Bax及Bcl-2的表達(dá)情況。
結(jié)果:
1.HE及
5、Masson染色顯示,于6周時(shí)肝硬化組大鼠發(fā)生肝硬化,表明造模成功。
2.模型治療組肝纖維化程度明顯低于模型組(P<0.01)。
3.肝硬化組門脈壓力明顯高于對(duì)照組(P<0.001),模型治療組門脈壓力明顯低于模型組(P<0.001)。
4.肝硬化組血清ALT及AST水平明顯高于對(duì)照組(P<0.001)。模型治療組血清ALT及AST水平明顯低于模型組(P<0.001)。
5.肝硬化組門脈血清IGF
6、-Ⅰ明顯低于對(duì)照組(P<0.001),模型治療組門脈血清IGF-Ⅰ明顯高于模型組(P<0.001);肝硬化組門脈血漿內(nèi)毒素水平明顯高于對(duì)照組(P<0.001),模型治療組門脈血漿內(nèi)毒素明顯低于模型組(P<0.001)。
6.肝硬化組盲腸中Occludin(P<0.001)和Claudin-1(P<0.001)蛋白表達(dá)及基因表達(dá)均低于對(duì)照組。模型治療組盲腸中Occludin(P<0.001)和Claudin-1(P<0.001)
7、蛋白表達(dá)及基因表達(dá)均高于模型組。
7.TUNEL表明,模型組凋亡水平明顯高于對(duì)照組(P<0.001),模型治療組凋亡水平明顯低于模型組(P<0.001)。模型組Bax基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.001),模型治療組Bax基因表達(dá)明顯低于模型組(P<0.001);模型組Bcl-2基因表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.001),模型治療組Bcl-2基因表達(dá)明顯高于模型組(P<0.001)。
結(jié)論:
外源性補(bǔ)充IG
8、F-Ⅰ在一定程度上恢復(fù)了肝硬化大鼠血中IGF-Ⅰ水平,改善肝硬化大鼠腸粘膜屏障功能,降低內(nèi)毒素水平,進(jìn)而改善肝功能,降低門脈壓力,減輕肝纖維化。
第二部分 IGF-Ⅰ對(duì)LPS損傷Caco-2細(xì)胞通透性影響及機(jī)制的研究
目的:
考察外源性IGF-Ⅰ對(duì)Caco-2單層細(xì)胞通透性的影響,并探討IGF-Ⅰ對(duì)Caco-2單層細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,觀察IGF-Ⅰ對(duì)Caco-
9、2單層細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)一步印證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
方法:
1.Caco-2單層細(xì)胞模型建立及及細(xì)胞分組:應(yīng)用高糖DMEM培養(yǎng)人結(jié)直腸腺瘤細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞。給藥前,取對(duì)數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞接種于6孔板,并應(yīng)用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞分為四組:LPS組應(yīng)用LPS(10μg/ml)作用細(xì)胞24小時(shí);IGF-Ⅰ組應(yīng)用IGF-Ⅰ(100ng/ml)作用細(xì)胞24小時(shí);LPS+IGF-Ⅰ組應(yīng)用LPS(10μ
10、g/ml)及IGF-Ⅰ(100ng/ml)同時(shí)作用細(xì)胞24小時(shí);不給藥組為對(duì)照組,每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。
2.應(yīng)用跨膜電阻(transepithelial electrical resistance,TEER)測(cè)量各組單層細(xì)胞的通透性。
3.通過western blot及RT-PCR方法觀察Caco-2單層細(xì)胞中Occludin和Claudin-1蛋白及基因表達(dá)情況。
4.應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)不同處理組單層細(xì)胞
11、凋亡情況,并應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Caco-2單層細(xì)胞凋亡基因Bax及Bcl-2的表達(dá)情況。
結(jié)果:
1.IGF-Ⅰ組TEER明顯高于對(duì)照組(P<0.001), LPS+IGF-Ⅰ組TEER明顯高于LPS組(P<0.001)。
2.IGF-Ⅰ組Occludin(P<0.001)和Claudin-1(P<0.001)蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組, IGF-Ⅰ組Occludin(P<0.001)和Claudin-1(P
12、<0.001)基因表達(dá)表達(dá)明顯高于對(duì)照組。LPS+IGF-Ⅰ組Occludin(P<0.001)和Claudin-1(P<0.001)蛋白表達(dá)明顯高于LPS組,LPS+IGF-I組Occludin(P<0.001)和Claudin-1(P<0.001)基因表達(dá)表達(dá)明顯高于LPS組。
3.TUNEL表明,IGF-I組凋亡水平明顯低于對(duì)照組(P<0.001),LPS+IGF-Ⅰ組凋亡水平明顯低于LPS組(P<0.001)。
13、 4.IGF-Ⅰ組Bax基因表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.001),LPS+IGF-Ⅰ組Bax基因表達(dá)水平明顯低于LPS組(P<0.001)。IGF-Ⅰ組Bcl-2基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.001),LPS+IGF-Ⅰ組Bcl-2基因表達(dá)水平明顯高于LPS組(P<0.001)。
結(jié)論:
外源性IGF-Ⅰ可以增加Caco-2單層細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達(dá),并下調(diào)Caco-2單
14、層細(xì)胞凋亡水平,進(jìn)而降低Caco-2單層細(xì)胞通透性。
第三部分 肝硬化患者IGF-1與肝功嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析
目的:
分析肝硬化患者胰島素樣生長因子Ⅰ與肝功嚴(yán)重程度的相關(guān)性。
方法:
1.收集2014年8月至2015年3月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院治療診斷為肝硬化患者101例。根據(jù)肝功能Child-Push分級(jí)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為三組,A組(A級(jí),5-6分)、B組(B級(jí),7-9分)、C組
15、(C級(jí),10-15分)。根據(jù)MELD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為三組,D組(<11分)、E組(11-18分)、F組(≥18)。
2.收集患者住院后的首次檢驗(yàn)檢查指標(biāo),檢測(cè)血清白蛋白(Albumin,ALB)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、肌酐(Creatinine,肌酐)、凝血酶原時(shí)間(prothrombintime,PT)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(international normalized radio,INR)。應(yīng)用酶
16、聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定血清IGF-Ⅰ水平。
結(jié)果:
1.在肝硬化的病因中,既往有飲酒史占總?cè)藬?shù)的14.85%;病毒性肝炎占總?cè)藬?shù)的52.48%;自身免疫性肝病占總?cè)藬?shù)的23.76%;其他原因者占總?cè)藬?shù)的8.91%。在失代償患者中,出現(xiàn)腹腔積液的占總?cè)藬?shù)的58.42%,出現(xiàn)自發(fā)性腹膜炎的占總?cè)藬?shù)的11.88%,出現(xiàn)消化道出血的占總?cè)藬?shù)的31.68%,出現(xiàn)肝性腦病的占總?cè)藬?shù)的48.51%。
2.IGF-Ⅰ與Chil
17、d-Pugh評(píng)分、MELD評(píng)分、凝血酶原時(shí)間、總膽紅素及INR均呈明顯負(fù)相關(guān),IGF-Ⅰ與血清白蛋白呈明顯正相關(guān),IGF-Ⅰ與患者的腎功能無相關(guān)性。
3.Child-Pugh分級(jí)越高,IGF-Ⅰ的水平就越低。在A組、B組、C組之間進(jìn)行兩兩比較時(shí)發(fā)現(xiàn),A組與B組、C組比較,P值均小于0.001,說明A組與B組、C組之間差異顯著。而在B組和C組之間比較時(shí),P值為0.327,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明在B組和C組之間,IGF-Ⅰ水平?jīng)]有差
18、異。
4.MELD分?jǐn)?shù)越高,IGF-Ⅰ的水平就越低。在D組、E組、F組之間進(jìn)行兩兩比較時(shí)發(fā)現(xiàn),D組與E組、F組比較,P值均小于0.001,說明D組與E組、F組之間差異顯著。而在E組和F組之間比較時(shí),P值為0.658,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明在E組和F組之間,IGF-Ⅰ水平?jīng)]有差異。
結(jié)論:
本文論證了IGF-Ⅰ與Child-Push分級(jí)、MELD評(píng)分、評(píng)價(jià)肝功能的主要指標(biāo)均有相關(guān)性,故IGF-Ⅰ可以作為評(píng)估肝臟
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