全人源埃博拉病毒中和抗體的研究.pdf

1、扎伊爾型埃博拉病毒（EBOV）能在人類和非人靈長類（NHPs）體內引發(fā)急性嚴重出血熱病，具有極強的傳染性和致死率。2014年西非爆發(fā)的埃博拉疫情推進了相關疫苗和抗病毒藥物的快速發(fā)展，但截止目前仍沒有獲批的預防或治療埃博拉病毒的藥物。埃博拉病毒的包膜糖蛋白（GP）在病毒入侵過程中扮演著關鍵的角色，是疫苗和抗體研究的重要靶標。實驗室前期自主研制的5型腺病毒載體的重組埃博拉疫苗已完成了 II期臨床試驗，在人體中具有良好的安全性，并且可有效地激

2、發(fā)免疫反應。由于疫苗需要在感染前使用才能達到保護效果，所以開展暴露后治療手段的研究很有必要，而單克隆抗體因其良好的特異性和藥代動力學特點，是目前免疫治療的研究熱點。本研究的目的是從疫苗臨床受試者體內篩選具有埃博拉病毒中和活性的單克隆抗體，并對其結合表位和保護機制進行研究，為埃博拉病毒的暴露后治療提供有效的手段。
　　首先，基于流式分選和單細胞 PCR的抗體篩選平臺，從疫苗受試者血樣中篩選獲得了GP的結合抗體。利用人類免疫缺陷病毒骨

3、架的重組EBOV假病毒對不同受試者的血清進行體外中和實驗，細胞感染的程度通過熒光素酶報告基因的表達水平來反映。各血清樣品對假病毒表現出不同程度的中和活性，選取中和活性較好的受試者血樣進行了流式分選。根據選定的表面分子標記策略，從外周血淋巴細胞中分離得到1920個抗體分泌細胞。然后通過單細胞反轉錄和巢式兩步PCR的方法，從單個抗體分泌細胞中擴增并挑選出462對自然配對的抗體輕重鏈可變區(qū)基因，陽性率為24％。為了快速、高通量地表達抗體，將配

4、對的抗體輕重鏈可變區(qū)基因分別構建成輕重鏈全長基因線性表達框，轉染至HEK293T細胞。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中的IgG含量及GP的結合活性，篩選得到32株GP結合陽性的抗體，得率為6.93%。對結合抗體基因的同源性分析顯示這些抗體兩兩不同，其亞類分布與正常人體內抗體的亞類分布一致。
　　其次，制備了四種截短型抗原，對純化抗體的結合特性進行進一步的分析。將抗體輕重鏈基因構建至pcDNA3.4質粒中，并在Expi293細胞中表達，

5、經Protein A親和純化，成功獲得了純化的單克隆抗體。為了分析單抗的結合區(qū)域，設計構建了四種截短型的 GP——GPecto、GPdmucin、sGP和 GP1。選擇分子量適中、在整個實驗設計中最為重要的GPdmucin，分別在原核、昆蟲和哺乳動物細胞中進行了表達和鑒定，以確定最佳的表達系統(tǒng)。結果顯示，原核系統(tǒng)表達的GPdmucin不穩(wěn)定，活性差；在昆蟲表達系統(tǒng)中，不溶性的 GPdmucin表達在細胞內；利用Expi293瞬時蛋白表達

6、系統(tǒng)，得到了可溶表達的GPdmucin，Ni柱親和層析獲得的目的蛋白純度達90%以上，且與特異抗體具有良好的結合活性。隨后對另外三種截短型的GP進行了表達和純化。用以上抗原對純化單抗進行了特異性及結合區(qū)域分析，17株單抗特異性良好，其中16株抗體能與四種截短型GP均發(fā)生結合，說明這些抗體結合于四種截短型GP所共有的sGP區(qū)域；1株抗體17F3僅能與GPecto和GPdmucin結合，不能與sGP和GP1結合，推測其結合于GP2亞基。

7、r>　　再次，在體外和體內對單抗的中和活性進行了評價。采用HIV-EBOV GP和VSV-EBOV GP假病毒分別在HEK293和Vero細胞上進行了中和實驗，一株抗體1B3對兩種假病毒均表現出較好的中和能力。在加拿大公共衛(wèi)生局國家微生物實驗室中進行的動物保護實驗結果顯示，感染EBOV后第1天和第2天單獨給藥，1B3抗體可分別提供90%和60%的存活率，起到顯著的保護作用。1B3對EBOV良好的中和活性提示其是一株潛在的EBOV治療抗體

8、。絲狀病毒的GP之間有著較高的序列同源性和結構相似性，尤其是受體結合區(qū)更為保守，而1B3可能與保守性的受體結合區(qū)存在作用，用多種絲狀病毒的GP對1B3的廣譜結合活性進行了分析，結果顯示1B3能夠與 BDBV GP交叉結合，但體外不能中和BDBV假病毒，說明1B3在BDBV上的結合方式不同于EBOV。
　　最后，對1B3抗體的結合表位與中和機制進行了研究。通過計算機軟件Discovery Studio，對1B3和GP的結合方式進行了

9、預測分析，得到兩者結合的關鍵氨基酸位點。構建GP關鍵位點的丙氨酸突變株，利用pDisplay載體將其展示在細胞表面，通過Western Blot和流式分析進行了驗證。得到GP上的關鍵氨基酸為位于受體結合區(qū)兩端的117和118、171和172兩對相鄰的氨基酸，這些位點突變后GP與1B3的結合活性丟失。這四位氨基酸在絲狀病毒的受體結合區(qū)上是保守的，通過構建突變株排除了該區(qū)域其他非保守氨基酸參與1B3結合的可能。但結合于sGP區(qū)域的1B3不能

10、與除了BDBV、EBOV以外的GP結合，提示聚糖帽上的一些位點可能參與了1B3的結合。借助已知結合表位的MIL77-1/-2/-3抗體，通過競爭結合實驗對1B3的表位進行了分析。1B3與結合于聚糖帽的 MIL77-3抗體競爭結合 GP，說明二者的表位空間接近或存在交疊。為了研究1B3的保護機制，用嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）體外酶切GPdmucin，切掉其上的聚糖帽，制備了激活態(tài)的GP（primed GP，GPcl）。同時，分

11、別在原核與哺乳動物系統(tǒng)中表達，制備了NPC1受體C結構域蛋白（NPC1-C）。受體結合抑制實驗結果顯示，1B3對GPcl與NPC1-C的結合并未呈現出濃度依賴的抑制作用，說明1B3不是通過阻斷GPcl與NPC1-C結合發(fā)揮保護作用的。進一步研究發(fā)現1B3與GPcl的結合活性丟失，說明聚糖帽對于1B3與GP的結合密切相關，以上實驗說明1B3可能通過與受體結合區(qū)117、118、171和172位關鍵氨基酸及聚糖帽某些位點或糖基共同形成的表位作

12、用發(fā)揮保護活性。在酶切阻斷實驗中，飽和結合1B3的GPdmucin仍可被thermolysin正常酶切，提示1B3不是通過阻斷酶切來發(fā)揮保護活性。
　　綜上所述，本研究從重組埃博拉疫苗臨床受試者體內篩選獲得了多株GP特異的抗體，大部分的抗體結合于 sGP區(qū)域；在哺乳動物表達系統(tǒng)中成功制備了不同的截短型GP，可用于 GP抗體分析、疫苗效果評價及病毒致病機理的相關研究；一株抗體1B3在細胞水平上和小鼠體內均呈現出較好的中和活性，是有前