CUEDC2啟動子及其轉錄因子的研究和CUEDC2打靶載體的構建.pdf

1、CUEDC2是一個功能尚不完全清楚的基因,位于人基因組10號染色體上,由9個外顯子組成,它包含CUE結構域,該結構域是一個含約40個氨基酸殘基的保守結構,廣泛存在于真核細胞的蛋白質中,它能與泛素結合,既能識別單泛素也能識別多泛素,并能夠促進分子內的單泛素化,含有CUE結構域的蛋白質在細胞內信號轉導過程中也發(fā)揮一定的作用。CUEDC2能夠和孕激素受體(PR)相互作用并抑制孕激素受體的活性,而且CUEDC2可以通過泛素蛋白酶體通路促進孕激素

2、受體的降解,干涉CUEDC2后在孕激素刺激下孕激素受體降解減少;而孕激素受體在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中有很重要的作用,提示CUEDC2可能對乳腺癌的進程有一定的抑制作用(The EMBO Journal,2007)。進一步的研究顯示,CUEDC2與IKK和蛋白磷酸酶1(PP1)存在同一復合體中,能夠通過招募PP1抑制IKK的磷酸化和激活,從而抑制NF-κB的激活,提示CUEDC2可能在炎性反應過程中也有一定的作用(Nature Immun

3、ology,2008)。
　　由于CUEDC2可能有很重要的生物學功能,所以本項研究運用生物信息學的方法預測了CUEDC2可能的啟動子區(qū)域和可能參與調控它的轉錄因子。用PCR的方法對預測的啟動子區(qū)域進行擴增,獲得300bp、600bp、1000bp和2000bp的DNA序列,經(jīng)測序鑒定正確后將其與不含啟動子的pEGFP1報告基因載體連接,轉染HEK293T細胞,通過熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)4個不同長度的DNA序列都能夠驅動綠色熒光的表

4、達,具有啟動子活性。為了進一步驗證克隆序列的啟動子活性,我們把4個不同長度的DNA序列和螢火蟲熒光素酶報告載體pGL3-Basic連接,轉染HEK293T細胞后通過熒光素酶活性測定發(fā)現(xiàn)4個DNA序列都具有較強的啟動子活性。我們選取一些轉錄因子和螢火蟲熒光素酶報告載體共同轉染細胞,發(fā)現(xiàn)NF-κB2/p52能夠很強的抑制CUEDC2啟動子的轉錄活性,并且在過表達p52的HEK293T細胞中,CUEDC2的mRNA量和內源CUEDC2蛋白量都

5、減少,進一步證實了p52是CUEDC2基因的轉錄抑制子。NF-κB1/p50也能抑制CUEDC2啟動子的轉錄活性,但抑制效果不如p52強,NF-κB另外一個亞基 p65/RelA對CUEDC2啟動子的轉錄活性沒有影響。其它的轉錄因子如HSF、C-jun和IRF3等對CUEDC2啟動子的轉錄活性幾乎沒有影響。為了更準確的定位啟動子的活性區(qū)域,我們對CUEDC2啟動子p600做了不同長度的截短,發(fā)現(xiàn)CUEDC2啟動子p600的活性區(qū)域在它的

6、3’端。為了找到和啟動子p600結合的蛋白,我們把鏈霉親和素磁珠和CUEDC2啟動子p600偶聯(lián),和HEK293T細胞核提取物孵育,經(jīng)SDS-PAGE分離后銀染,實驗組和對照組比較有一條有差異的銀染條帶。
　　為了進一步研究CUEDC2的功能,我們構建了CUEDC2條件打靶載體和非條件打靶載體,為了篩選中靶細胞,針對打靶載體設計并驗證了Southern印記雜交用的探針。打靶載體電轉小鼠ES細胞后,通過正負篩選標記篩選和Southe