自身免疫甲狀腺病T、B淋巴細(xì)胞DNA總體甲基化修飾的研究.pdf

1、目的:自身免疫甲狀腺病(Autoimmune thyroid diseases，AITD)是常見(jiàn)的器官特異性自身免疫病，主要包括:Graves'?。℅raves'disease，GD）、Graves'眼病(Graves'ophthalmopathy，GO)和自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmunethyroiditis，AIT)，共同的臨床特征是血清甲狀腺自身抗體陽(yáng)性、甲狀腺/眶周組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。AITD在我國(guó)人群中的發(fā)病率約為10

2、％，主要危害是甲狀腺功能異常引起的代謝紊亂。AITD是遺傳和環(huán)境因素共同作用下的免疫穩(wěn)態(tài)失衡，具體病因尚不明確。碘是AITD發(fā)病的重要環(huán)境因素，高碘地區(qū)AITD發(fā)病率顯著升高;T、B淋巴細(xì)胞功能紊亂和比例變化是AITD重要的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，x染色體偏倚失活、小RNA干擾等表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控也被證實(shí)參與AITD的發(fā)生和發(fā)展，而目前缺乏DNA甲基化參與AITD發(fā)病的數(shù)據(jù)。因此，本研究的前期工作旨在探討T、B淋巴細(xì)胞DNA總體甲基化修

3、飾在AITD患者和SAT動(dòng)物模型中的作用，并設(shè)計(jì)隨訪研究觀察臨床治療對(duì)AITD患者淋巴細(xì)胞DNA總體甲基化水平的影響。
　　GO是AITD中較為嚴(yán)重的一種臨床類(lèi)型，臨床表現(xiàn)以突眼為特征，診斷及治療不及時(shí)會(huì)給患者帶來(lái)容貌改變、眼部疼痛、復(fù)視、致盲等嚴(yán)重后果。多種甲狀腺疾病可引起GO眼部損害，其中97％為GD，其次為橋本病、甲狀腺腺瘤、甲狀腺癌等。突眼度值是臨床上評(píng)估GO嚴(yán)重度和活動(dòng)度的一個(gè)重要指標(biāo)，而突眼度值的診斷價(jià)值建立于精準(zhǔn)的測(cè)

4、量方法和適合的正常參考范圍。目前，我國(guó)GO突眼的診斷仍然以其他國(guó)家和種族的正常參考范圍為診斷依據(jù)，而大量文獻(xiàn)證實(shí)不同人群和種族的突眼度參考范圍存在異質(zhì)性，故很有必要在中國(guó)巨大的人口中建立特異性的突眼度正常參考范圍。本研究在中國(guó)東北沈陽(yáng)地區(qū)漢族人群建立正常雙側(cè)眼球突出度參考范圍以幫助專(zhuān)科醫(yī)生有效診斷突眼病指導(dǎo)治療。
　　研究方法:
　　第一部分:4周齡NOD.H-2h4小鼠、昆明小鼠各20只，每組隨機(jī)分為高碘飲水組(HI)及正

5、常碘飲水組(CON)。于高碘干預(yù)16周后處死小鼠，取血清測(cè)定甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody，TgAb)滴度，小鼠甲狀腺組織石蠟包埋、切片、HE染色并評(píng)估甲狀腺炎程度;同時(shí)取小鼠脾臟制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，流式分選CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞，分別提取DNA和RNA，檢測(cè)細(xì)胞DNA總體甲基化水平和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltansferases，DNMTs) mRNA表達(dá)水平。
　　于20

6、13年8月-2014年10月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌門(mén)診及無(wú)錫江原醫(yī)院內(nèi)分泌門(mén)診收集初發(fā)GD患者51例、初發(fā)AIT患者28例、單純抗體陽(yáng)性者29例;于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心隨機(jī)選取志愿者38例做為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):1）性別不限。2）年齡15-70歲。3）彌漫性甲狀腺腫，甲狀腺功能亢進(jìn)，TRAb＞10 U/L者納入初發(fā)GD組;甲狀腺功能減退，TPOAb/TgAb＞300 IU/ml者納入初發(fā)AIT組;未經(jīng)治療的，甲狀腺功

7、能正常，僅TPOAb/TgAb升高者納入單純抗體陽(yáng)性組;甲狀腺自身抗體正常，甲狀腺功能正常，性別、年齡與病例組相匹配的健康者納入對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn):1）既往患甲狀腺疾病，服用藥物治療者或放射碘、手術(shù)治療史。2）其他自身免疫病、慢性炎癥性疾病、腫瘤、近期嚴(yán)重感染（肝炎等）病史;一個(gè)月內(nèi)曾應(yīng)用免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑。以上各組研究對(duì)象記錄性別、年齡，血清檢測(cè)游離三碘甲腺原氨酸(Free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離甲狀腺素(

8、Free thyroxine，F(xiàn)T4)、促甲狀腺激素釋放激素(Thyroid stimulating hormone，TSH)、甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(Thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、TgAb，初發(fā)GD組患者增加促甲狀腺激素受體抗體(TSH receptor antibody，TRAb)檢測(cè)?？鼓o脈血分離單個(gè)核細(xì)胞，流式分選CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞，分別提取DNA、RNA，檢測(cè)細(xì)胞DNA總體

9、甲基化水平，DNMTs mRNA表達(dá)水平。
　　初發(fā)GD組其中17例給予規(guī)律抗甲藥治療，34例給予放射碘治療;初發(fā)AIT組給予左甲狀腺素替代治療。以上患者均在治療3個(gè)月后進(jìn)行隨訪。血清檢測(cè)FT3、FT4、TSH、TPOAb、TgAb以評(píng)估治療效果，初發(fā)GD組患者加測(cè)TRAb?？鼓o脈血分離單個(gè)核細(xì)胞，流式分選CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞，分別提取DNA、RNA，檢測(cè)細(xì)胞DNA總體甲基化水平，DNMTs mRNA的表達(dá)水平。

10、r>　　第二部分:在中國(guó)東北沈陽(yáng)地區(qū)隨機(jī)選取年齡在8-87歲的正常漢族人群2010人，其中女性1051人、男性959人，并排除患有可影響眼眶或眼球的全身或局部疾病病史的人群。入組研究對(duì)象按年齡分為4組:兒童組（8-14歲）515例;青少年組（15-19歲）517例;成人組（20-69歲）582例;老年組（70-87歲）396例。利用Hertel突眼計(jì)測(cè)量人群雙眼突眼度及眶距。突眼度正常參考范圍的上限被定義為均值+2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，得出中國(guó)東北

11、沈陽(yáng)地區(qū)漢族人群特異性的正常突眼值參考范圍。
　　結(jié)果:
　　第一部分:1、NOD.H-2h4小鼠-HI血清TgAb OD值明顯增高，甲狀腺炎評(píng)分升高，與NOD.H-2h4小鼠-CON組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。昆明小鼠高碘飲水組及正常碘飲水組均未發(fā)生甲狀腺炎。NOD.H-2h4-HI小鼠CD3+T、CD19+B細(xì)胞中DNA總體甲基化水平及DNMTs mRNA的表達(dá)水平與其他組相比均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

12、CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞中DNMTs mRNA表達(dá)水平及DNA總體甲基化水平與血清TgAb OD值之間無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。
　　2、初發(fā)GD組患者CD3+T、CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平與對(duì)照組相比明顯降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001);初發(fā)AIT組CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平與對(duì)照組相比明顯降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)，而初發(fā)AIT組CD3+T細(xì)胞DNA甲基化水平與對(duì)照組相比無(wú)

13、明顯變化;單純抗體陽(yáng)性組CD3+T、CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平與對(duì)照組相比無(wú)差異(P＞0.05)。初發(fā)GD組患者CD3+T、CD19+B細(xì)胞DNMT1 mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比均明顯降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，而CD3+T、CD19+B細(xì)胞DNMT3a、DNMT3b水平與對(duì)照組無(wú)差異;初發(fā)AIT組患者CD19+B細(xì)胞DNMT3a mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.03)，

14、而CD19+B細(xì)胞DNMT1、DNMT3b mRNA表達(dá)水平及CD3+T細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;單純抗體陽(yáng)性組CD3+T、CD19+B細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均無(wú)差異。
　　3、初發(fā)GD組患者治療3個(gè)月后CD3+T、CD19+B細(xì)胞中DNA總體甲基化水平較治療前升高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001，P=0.004)。

15、其中，初發(fā)GD患者藥物治療組治療后CD3+T、CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平較治療前明顯升高，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007，P=0.006);初發(fā)GD患者放射碘治療組治療后CD3+T細(xì)胞DNA總體甲基化水平增加，與治療前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)，而CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平治療前后無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.230)。初發(fā)GD組患者治療3個(gè)月后CD3+T、CD19+B細(xì)胞中DNMT1 mRNA表達(dá)水平較治療前增

16、加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001，P＜0.001)，而DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA表達(dá)水平治療前后相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。初發(fā)GD患者藥物治療組和放射碘治療組DNMT1 mRNA表達(dá)水平都明顯升高，與治療前相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。初發(fā)AIT組患者左旋甲狀腺素替代治療后CD3+T、CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平及DNMTs mRNA表達(dá)水平與治療前相比有升高但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　

17、第二部分:1、總體眼球突出度值范圍為10 mm-22 mm，均值左眼15.0 mm±1.9mm，右眼15.0 mm±2.0 mm。雙側(cè)眼球正常突眼度上限值（平均值+2SD）分別為:兒童組:左16.9mm，右16.7mm;青少年組:左18.1mm，右18.3mm;成人組:雙側(cè)均為19.3mm;老年組:左19.7mm，右19.9mm。
　　2、研究對(duì)象總體眶距范圍為87 mm-122 mm，均值為107.6 mm±6.3 mm。

18、>　　3、各年齡組人群的左、右眼球突出度具有顯著的相關(guān)性。兒童組和青少年組年齡和突眼度值呈明顯正相關(guān)，而老年組年齡和突眼度值呈負(fù)相關(guān)。所有年齡組人群中，雙眼突眼度值和眶距呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:1、NOD.H-2h4小鼠SAT模型T、B淋巴細(xì)胞DNA總體甲基化水平及DNMTs mRNA表達(dá)水平較非甲炎組小鼠無(wú)改變，說(shuō)明T、B淋巴細(xì)胞DNA總體甲基化不參與小鼠SAT發(fā)病。昆明小鼠高碘組與正常碘組相比T、B淋巴細(xì)胞DNA總體甲基化水平及

19、DNMTs mRNA表達(dá)水平無(wú)差異，說(shuō)明高碘并不影響DNA總體甲基化修飾水平。
　　2、初發(fā)GD患者外周血CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平較對(duì)照組降低，提示DNA甲基化修飾與GD患者的發(fā)病有關(guān);DNMT1 mRNA表達(dá)減少可能是其DNA總體甲基化水平降低的原因。初發(fā)AIT患者CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平與B細(xì)胞DNMT3a mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低，而CD3+T細(xì)胞總體甲基化水平及DNMTs mRN

20、A表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)差異，提示DNMT3a介導(dǎo)的B細(xì)胞DNA總體甲基化修飾參與AIT發(fā)病，而T細(xì)胞總體甲基化修飾可能與AIT發(fā)病無(wú)關(guān)。
　　3、初發(fā)GD患者經(jīng)有效的臨床治療后，CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平和DNMT1 mRNA表達(dá)水平較治療前升高，提示藥物或放射碘治療可能通過(guò)影響淋巴細(xì)胞DNA總體甲基化修飾而改善臨床癥狀。初發(fā)GD患者藥物治療組CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞DNA甲基化水平均升高，而放射碘

21、治療組治療后只有CD3+T細(xì)胞DNA總體甲基化水平增加，而CD19+B細(xì)胞DNA總體甲基化水平治療前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示藥物治療和放射碘治療可能改變不同的淋巴細(xì)胞亞群的DNA甲基化水平。
　　4、建立了中國(guó)東北沈陽(yáng)地區(qū)漢族人群特異性突眼度正常值。雙側(cè)眼球正常突眼度上限值（平均值+2SD）分別為:兒童組:左16.9mm，右16.7mm;青少年組:左18.1mm，右18.3mm;成人組:雙側(cè)均為19.3mm;老年組:左19.7mm，