黃瓜枯萎病高效拮抗枯草芽孢桿菌的篩選及生防機(jī)制研究.pdf

1、黃瓜枯萎病是保護(hù)地黃瓜生產(chǎn)中的嚴(yán)重障礙，由于防治過程中化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，目前已造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和經(jīng)濟(jì)損失，因此研制高效、安全、無污染的綠色生物農(nóng)藥顯得尤為迫切?？莶菅挎邨U菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢生物種群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用，在生物防治領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用開發(fā)潛力。篩選高效拮抗黃瓜枯萎病菌的枯草芽孢桿菌，研究菌株作用機(jī)理以及田間防治效果具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　本文從采集的10份植物根圍土樣中，以黃瓜枯

2、萎病菌尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）為指示菌株，篩選出1株高效廣譜拮抗生防菌株B29。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)及 BIOFOSUN微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
　　利用單因子實(shí)驗(yàn)對枯草芽孢桿菌B29菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基為1％全糖粉、0.6%牛肉膏和0.3%酵母膏；最適培養(yǎng)條件為溫度30℃、初始pH值7.0～7.5、裝

3、液量50mL/250mL、接種種齡15～18h、培養(yǎng)時(shí)間32h。研究了B29菌株的20L自控罐發(fā)酵和2000L發(fā)酵罐中試發(fā)酵，在穩(wěn)定的中試生產(chǎn)工藝下生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌菌劑達(dá)每毫升35億活芽孢。
　　通過室內(nèi)生測試驗(yàn)，求出B29菌株抑制尖鐮孢菌生長的有效中濃度EC50=9.17×105活芽孢/mL。1年2季4點(diǎn)田間小區(qū)試驗(yàn)表明：35億/毫升枯草芽孢桿菌100×（3.5×107cfu/mL）、250×（1.4×107cfu/mL）和5

4、00×（7×106cfu/mL）稀釋菌液對黃瓜枯萎病的防效分別為70.3～88.2%、62.3～85.9%和54.7～80.6%。2年田間大區(qū)示范中，枯草芽孢桿菌B29菌劑（7×106cfu/mL）對黃瓜枯萎病防效達(dá)84.9%，增產(chǎn)12.57%。
　　研究了35億/毫升枯草芽孢桿菌菌劑的毒理學(xué)、對環(huán)境生物的毒性和對田間幾種主要蔬菜及作物的安全性。結(jié)果枯草芽孢桿菌菌劑急性經(jīng)口、經(jīng)皮毒性 LD50均大于5000 mg/kg，屬于微毒類

5、；對家兔皮膚無刺激性，對家兔眼為輕度刺激性；致敏率為0，屬弱致敏物。35億/毫升枯草芽孢桿菌菌劑對鵪鶉、蜜蜂、斑馬魚、家蠶的急性毒性為低毒級。另外枯草芽孢桿菌 B29菌株對幾種主要蔬菜及作物種子的出苗和生長發(fā)育沒有不良影響。
　　對枯草芽孢桿菌 B29菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)條件為溫度30℃、初始pH值7.5、裝液量75mL/250mL、培養(yǎng)時(shí)間120h。利用30%~70%(NH)2SO4飽和溶液從

6、發(fā)酵液中提取獲得的抗菌粗提物對高溫具有一定的穩(wěn)定性；對蛋白酶 K具有部分耐受性，對胰蛋白酶和胃蛋白酶較敏感。經(jīng) DEAE-52纖維素吸附和Bio-Gel?P-100分子篩凝膠層析分離，成功純化獲得具有抑菌活性的單一蛋白組分 B29I；通過 SDS-PAGE、IEF-PAGE和HPLC測定該蛋白分子量為42.3kDa，等電點(diǎn)為5.69，純度達(dá)97.81%；通過質(zhì)譜分析獲得了抗菌蛋白 B29I的肽指紋圖譜，經(jīng)檢索初步確定抗菌蛋白B29I為一

7、種新蛋白，其N端序列為 GRIWHN，3個(gè)隨機(jī)肽段序列分別為KTHVLEDEFK，KGYQTGDFGAYLH和RTYEVAEESPVLGL。研究了抗菌蛋白 B29I的抑菌能力和作用機(jī)理，結(jié)果表明，抗菌蛋白 B29I抑制尖鐮孢菌和立枯絲核菌菌絲生長的IC50值分別為45μM和112μM；抗菌蛋白B29I明顯抑制尖鐮孢菌（F. oxysporum）孢子萌發(fā)，并抑制芽管伸長，同時(shí)導(dǎo)致部分萌發(fā)的孢子變形扭曲、腫脹和破裂。
　　采用利福平抗

8、性誘導(dǎo)和黃綠熒光蛋白基因分別對枯草芽孢桿菌B29菌株進(jìn)行標(biāo)記，研究該生防菌在黃瓜幼苗根際的定殖規(guī)律。結(jié)果在溫室和田間自然條件下，通過浸種、灌根或兩種處理方式相結(jié)合，枯草芽孢桿菌 B29菌株均可在黃瓜幼苗根內(nèi)、莖基部和根際土壤中很好地定殖。浸種和灌根相結(jié)合的處理方式利于生防菌的定殖。該菌株較強(qiáng)的定殖能力使其可以充分發(fā)揮空間、營養(yǎng)競爭和抑制病菌的作用，從而表現(xiàn)較好的防治效果。
　　對枯草芽孢桿菌 B29菌株誘導(dǎo)黃瓜根系相關(guān)防御反應(yīng)酶活