ORAOV1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:結(jié)腸癌(CRC，colorectal cancer)是目前發(fā)病率、診斷率均較高的胃腸道惡性腫瘤，好發(fā)于50-65歲之間的人群。據(jù)WHO統(tǒng)計，全球每年新增結(jié)腸癌患者近100萬，而每年有約60萬人口死于結(jié)腸癌。全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示:對于男性而言，結(jié)腸癌的發(fā)病率緊隨肺癌和前列腺癌，位居第三，而對于女性而言則是位于第二位的惡性腫瘤。結(jié)腸癌給人類健康帶來的威脅極大，嚴(yán)重影響著患者健康及生活質(zhì)量。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，影響結(jié)腸癌發(fā)病的因素在發(fā)展中國家

2、和發(fā)達(dá)國家之間不盡相同且具有明顯的地域性，且在發(fā)展中國家其發(fā)病率與診斷率不斷攀升，相較而言，低教育水平、低收入的人群結(jié)腸癌的發(fā)病率更高，這可能與相關(guān)人群的飲食習(xí)慣有關(guān)，在東亞國家結(jié)腸癌的發(fā)病與食用腌肉、肥胖、吸煙等因素有關(guān)。有關(guān)結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的研究很多，目前公認(rèn)的理論為:癌基因與抑癌基因的表達(dá)異常與之關(guān)系密切，但其發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制仍未得到闡明。
　　染色體11q13區(qū)域的過度擴(kuò)增現(xiàn)象廣泛存在于各類腫瘤組織中，在肝癌、胃癌及結(jié)

3、腸癌等消化系腫瘤中也同樣存在，且與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)?？谇话┻^表達(dá)蛋白1(ORAOV1，ora1 cancer overexpressed protein1)又稱腫瘤過表達(dá)序列1(TumorAmplified and overexpressed seuqnce1)，編碼基因定位于染色體11q13.3區(qū)域內(nèi)，與Cyclin D1編碼基因相鄰，最初發(fā)現(xiàn)于口腔上皮腫瘤中，在體內(nèi)廣泛表達(dá)，以肝、胰腺、腎組織腫瘤中表達(dá)較高。既往研究表明，在結(jié)

4、腸癌發(fā)生過程中存在11q13的過度擴(kuò)增，特別是與該區(qū)域的Cyclin D1基因過表達(dá)密切相關(guān)，但Cyclin D1基因過表達(dá)不能完全解釋結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，而ORAOV1的基因定位與Cyclin D1相鄰，且在食管鱗狀細(xì)胞癌的研究中表明:食管癌細(xì)胞中不僅Cyclin D1存在過表達(dá)現(xiàn)象，ORAOV1亦存在過度擴(kuò)增，因此，我們推測在結(jié)腸癌組織中ORAOV1的表達(dá)也可能發(fā)生變化，并可能參與調(diào)控了結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。為驗證上述假設(shè)，

5、本研究擬在結(jié)腸癌及其相應(yīng)的癌旁組織中檢測ORAOV1的表達(dá)變化，并初步探討該基因如何影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力和可能的原因，以期為結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及潛在治療靶點的尋找提供實驗依據(jù)。
　　方法:1.收集結(jié)腸癌切除術(shù)患者的結(jié)腸癌組織和癌旁組織:經(jīng)中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會審查并取得患者及家屬的知情同意后，2013年9月至2015年6月間，我們通過第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院普外科收集結(jié)腸癌切除術(shù)患者的結(jié)腸癌組織和

6、癌旁組織。收集的標(biāo)本為:3.0×2.0×0.3cm，切成0.5×0.5×0.3cm，一部分保存于液氮中備用，另一部分做石蠟包埋，通過病理組織切片鑒定所收集的組織是否為結(jié)腸癌組織。
　　2.利用人體組織標(biāo)本研究ORAOV1在結(jié)腸癌的表達(dá):(1)提取患者結(jié)腸癌組織和癌旁組織的RNA，逆轉(zhuǎn)錄后在mRNA水平研究ORAOV1是否表達(dá)增高;(2)提取患者的結(jié)腸癌組織和癌旁組織的總蛋白，在蛋白水平研究ORAOV1是否表達(dá)增高。以明確ORAOV

7、1與結(jié)腸的發(fā)生具有相關(guān)性。
　　3.利用LoVo和SW480細(xì)胞研究ORAOV1基因促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生的可能分子機(jī)制:構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-sh-ORAOV1質(zhì)粒和其相應(yīng)的對照質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染LoVo和SW480細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;通過CCK8和流式細(xì)胞學(xué)實驗，分別檢測細(xì)胞增殖與凋亡情況，以明確ORAOV1基因的表達(dá)與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)。
　　結(jié)果:1.在人結(jié)腸癌組織和癌旁組織的研究:
　　(1)通過對人結(jié)腸

8、癌組織進(jìn)行H.E.染色對所收集的結(jié)腸癌標(biāo)本進(jìn)行病理分型，證實:我們所收集的結(jié)腸癌組織絕大部分為腺癌組織。
　　(2)分別提取了結(jié)腸癌切除術(shù)患者的結(jié)腸癌組織和癌旁組織的mRNA和總蛋白，利用RT-qPCR和Western Blot技術(shù)檢測ORAOV1的表達(dá)情況，證實:不論在mRNA水平還是蛋白水平，與癌旁組織相比，ORAOV1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高。
　　2.利用LoVo和SW480細(xì)胞的研究:
　　(1)成功構(gòu)建了OR

9、AOV1 siRNA-LoVo、ORAOV1 siRNA-LoVo NC、ORAOV1siRNA-SW480、ORAOV1 siRNA-SW480 NC細(xì)胞株:pGPU6/GFP/Neo-sh-ORAOV1質(zhì)粒和其相應(yīng)的對照質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染LoVo和SW480細(xì)胞，G4182000ug/ml篩選細(xì)胞5天后改為半量持續(xù)穩(wěn)壓篩選，提取各細(xì)胞株RNA，利用RT-qPCR檢測ORAOV1基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明:與LoVo WT（正常LoVo細(xì)胞

10、株）相比，ORAOV1 siRNA-LoVoNC細(xì)胞ORAOV1基因表達(dá)無明顯變化，而ORAOV1 siRNA-LoVo則顯著降低;在SW480 WT、ORAOV1 siRNA-SW480、ORAOV1 siRNA-SW480 NC細(xì)胞株中的結(jié)果與LoVo細(xì)胞株相似。因此，我們成功構(gòu)建了ORAOV1 siRNA-LoVo、ORAOV1 siRNA-LoVo NC、ORAOV1 siRNA-SW480、ORAOV1 siRNA-SW480

11、 NC細(xì)胞株。
　　(2) CCK8實驗檢測0RAOV1 siRNA-LoVo、ORAOV1 siRNA-LoVo NC、LoVoWT、ORAOV1 siRNA-SW480、ORAOV1 siRNA-SW480 NC、SW480 WT細(xì)胞株的增殖情況:連續(xù)培養(yǎng)各細(xì)胞株96h，并于24h，48h，72h，96h進(jìn)行CCK8檢測，結(jié)果表明:不論在LoVo細(xì)胞系還是SW480細(xì)胞系，ORAOV1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ORAOV1低表達(dá)

12、，細(xì)胞增殖顯著低于ORAOV1正常表達(dá)組。
　　(3)流式細(xì)胞學(xué)對各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株細(xì)胞周期的檢測，結(jié)果表明:在LoVo細(xì)胞中，ORAOV1 siRNA-LoVo細(xì)胞處于S期的比例要明顯高于ORAOV1 siRNA-LoVo NC細(xì)胞(45.25％±3.17％,33.93％±2.23％, P＜0.05)和LoVo WT細(xì)胞(45.25％±3.17％,34.56％±2.20％,P＜0.05)，而ORAOV1 siRNA-LoVo NC細(xì)胞

13、與LoVo WT細(xì)胞則無顯著差異(33.93％±2.23％，34.56％±2.20％，P＞0.05)。而在SW480細(xì)胞中，結(jié)果顯示:ORAOV1siRNA-SW480細(xì)胞處于的S期比例為54.49％±2.57％，而ORAOV1 siRNA-SW480 NC細(xì)胞處于S期比例僅為40.08％±2.36％，SW480 WT為40.12％±1.93％，與ORAOV1siRNA-SW480 NC細(xì)胞和SW480 WT細(xì)胞相比，ORAOV1 si

14、RNA-SW480 NC細(xì)胞處于S期比例顯著增高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。而ORAOV1 siRNA-SW480 NC細(xì)胞和SW480 WT細(xì)胞相比較，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明:ORAOV1低水平表達(dá)可引起結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期發(fā)生S期阻滯，降低增殖能力。
　　(4)流式細(xì)胞學(xué)對各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株早期調(diào)亡的檢測，結(jié)果顯示:在LoVo細(xì)胞中，ORAOV1 siRNA-LoVo細(xì)胞的早期凋亡比例高于ORAOV1 siRNA-LoVo NC細(xì)胞(9

15、.13％±1.39％,4.71％±0.65％,P＜0.05)及LoVo WT細(xì)咆(9.13％±1.39％,3.68％±0.36％，P＜0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;而ORAOV1 siRNA-LoVo NC細(xì)胞與LoVo WT細(xì)胞之間的早期凋亡則無明顯變化（4.71％±0.65％，3.68％±0.36％，P＞0.05）。而在SW480細(xì)胞中相似的結(jié)果。即:ORAOV1 siRNA-SW480細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞比例高于ORAOV1 s

16、iRNA-SW480 NC細(xì)胞(15.76％±1.76％，6.74％±0.58％，P＜0.05)，也同樣高于SW480 WT細(xì)胞（15.76％±1.76％，5.82％±0.60％，P＜0.05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。且ORAOV1 siRNA-SW480 NC細(xì)胞組與SW480 WT細(xì)胞之間無明顯差異(6.74％±0.58％，5.82％±0.60％，P＞0.05)。以上結(jié)果表明:ORAOV1低表達(dá)可增加結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo及SW480的