體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化及AFM的可視化研究.pdf

1、　　胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES cell)在細(xì)胞誘導(dǎo)分化方面具有可塑性強(qiáng)、分裂增值旺盛和免疫原性低等特點(diǎn),為進(jìn)行細(xì)胞移植治療疑難疾病帶來希望。為了能夠揭示ES細(xì)胞在體外細(xì)胞因子的調(diào)控下發(fā)生定向分化,其膜表面形態(tài)學(xué)的變化及其對應(yīng)的生物學(xué)意義,本文在體外培養(yǎng)BALB/c小鼠ES細(xì)胞定向分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán),利用原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)追蹤觀察培養(yǎng)各時(shí)期細(xì)胞表面形態(tài)學(xué)上

2、的變化,探索AFM在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
　　本文首先選用BALB/c小鼠ES細(xì)胞,培養(yǎng)至擬胚體自然分化四天,然后轉(zhuǎn)入白明膠處理的培養(yǎng)板上使擬胚體貼壁生長,在特定時(shí)間段分別于培養(yǎng)液中添加一系列細(xì)胞因子(bFGF、IGF-1和Nicotinamide),使ES細(xì)胞定向分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán),并且在培養(yǎng)的每個(gè)時(shí)期用AFM掃描細(xì)胞,這在國內(nèi)、外尚屬首次。本文首次從超微形態(tài)上發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞增殖克隆的兩種方式(對稱性分裂和非對稱性分裂),以及擬

3、胚體至轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)期間細(xì)胞表面形貌的變化：加入生長因子bFGF后,內(nèi)胚層細(xì)胞大量增殖,外胚層的分化接受其調(diào)控變得有序起來,掃描外胚層先發(fā)現(xiàn)大量類似于神經(jīng)纖維(包括樹突和軸突)的細(xì)胞,隨后類似神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞幾乎相互連成網(wǎng)絡(luò)狀,纖維交織雜亂,還觀察到接近于圓形的細(xì)胞,可能是分化出的神經(jīng)元,作為信息交流傳導(dǎo)的中樞。添加生長因子IGF-1和Nicotinamide后,外胚層細(xì)胞隨時(shí)間的推進(jìn)而逐漸減少,內(nèi)胚層細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán),但是在其細(xì)胞膜

4、上,我們卻沒有觀察到很大的變化。結(jié)合ICC結(jié)果,觀察到表達(dá)胰島B細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量龐大,在陽性細(xì)胞的表面有豐富的纖維組織,這些類神經(jīng)細(xì)胞纖維可能調(diào)節(jié)其激素的釋放,從而首次從超微形態(tài)上有力地印證了外胚層的神經(jīng)干細(xì)胞和內(nèi)胚層的胰島干細(xì)胞是同源的理論,為細(xì)胞的移植療法提供了可靠的憑據(jù)。另外還通過添加不同的生長因子,誘導(dǎo)BALB/c小鼠ES細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞,并最終獲得32%的高分化率。
　　通過AFM的運(yùn)用,我們可以從完全不同于傳統(tǒng)生物學(xué)