黑曲霉木聚糖酶基因克隆、表達(dá)與熱穩(wěn)定性改造研究.pdf

1、木聚糖廣泛存在于植物細(xì)胞壁中，是自然界中含量僅次于纖維素的可再生資源。木聚糖的來源不同，分枝程度不同，其主鏈和支鏈帶有的基團(tuán)也不同。由于木聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成。木聚糖酶(β-1，4-xylanase，EC3.2.1.18)能夠以內(nèi)切方式作用于木聚糖分子中的β-1，4糖苷鍵產(chǎn)生不同長度的木寡糖和少量的木糖，因此是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。 本文以1株木聚糖酶產(chǎn)生菌黑曲霉(Aspergill

2、usniger)F19為實(shí)驗(yàn)菌株，系統(tǒng)地研究了黑曲霉木聚糖酶基因xynA與xynB的克隆以及在大腸桿菌(Escherichiacoli)中的表達(dá)、重組木聚糖酶XynB的純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究，并進(jìn)行了木聚糖酶XynB的熱穩(wěn)定性改造，得到了SS2、ST5、SST7共3個(gè)突變體，主要結(jié)論如下： 1.xynA與xynB的克隆以及在大腸桿菌中的表達(dá)以黑曲霉(A.niger)F19的基因組DNA為模板，根據(jù)GenBank報(bào)道的黑曲霉xynA

3、與xynB的全序列設(shè)計(jì)兩對引物，PCR擴(kuò)增得到木聚糖酶基因xynA和xynB。將不帶原基因信號肽編碼序列的xynA和xynB以正確的閱讀框架克隆到大腸桿菌(E。coli)表達(dá)載體pET-28a(+)上，并轉(zhuǎn)化EcoliBL21，獲得重組工程菌BLX1和BLX2。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，XynA和XynB都獲得特異性表達(dá)，XynA以包涵體和胞內(nèi)可溶性蛋白2種形式存在，而XynB表達(dá)的蛋白全部以胞內(nèi)可溶性蛋白形式存在。 2.木聚糖酶Xyn

4、B的純化木聚糖酶XynB重組表達(dá)蛋白以胞內(nèi)可溶性蛋白的形式存在，且木聚糖酶基因xynB是和pET-28a(+)融合表達(dá)，木聚糖酶XynB的羧基端帶有6×His蛋白表達(dá)標(biāo)簽，所以我們用Ni-NTA親和層析柱對木聚糖酶XynB進(jìn)行了純化，并使其純度達(dá)到了電泳純水平，在SDS-PAGE上呈現(xiàn)出清晰的單一條帶。 3.木聚糖酶XynB的酶學(xué)性質(zhì)分析利用純酶分析XynB的酶學(xué)性質(zhì)，木聚糖酶XynB的比活達(dá)到13500±128.4IU/mg，

5、其Km和Vmax分別為12.5±0.08mg/mL，289±10.8μmol/min/mg。它的最適反應(yīng)pH為5.0，在pH4.0～7.0之間保持最高活力的75％以上。該重組酶表現(xiàn)出很高的pH穩(wěn)定性，在pH3.0～8.0內(nèi)常溫環(huán)境下放置6h，殘余酶活保持在68％以上。XynB的最適反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)溫度小于30℃或大于60℃的情況下重組木聚糖酶表現(xiàn)出較低的活性。該酶熱穩(wěn)定較差，在40℃以下較為穩(wěn)定，60℃以上重組酶活性下降很快，60

6、℃條件保溫30min后殘余酶活為20％。在10mmol/L濃度下不同金屬離子對酶活力的影響研究表明，Zn2+、Co2+離子對重組酶有激活作用，分別使重組酶活性提高了8％和15％，Mn2+使重組酶的相對活性降低了21％，體現(xiàn)出對該酶活性一定的抑制作用，其他金屬離子對重組酶活性的影響不大。 4.木聚糖酶XynB的熱穩(wěn)定性改造由于XynB的比活較高，但是其熱穩(wěn)定性較差，這在一定程度上限制了木聚糖酶XynB在工業(yè)水平上的推廣應(yīng)用。為了提

7、高XynB的熱穩(wěn)定性，我們采用了兩種定點(diǎn)誘變的策略：一種是將木聚糖酶表面的Ser/Thr替換為Arg，提高XynB表面蛋白的正電荷數(shù)及其電解常數(shù)以提高蛋白的熱穩(wěn)定性；另外一種是在木聚糖酶的非催化區(qū)域引入二硫鍵，使其結(jié)構(gòu)更加緊密從而提高其熱穩(wěn)定性。將正確的突變體SS2、ST5、SST7基因xynB'構(gòu)建到表達(dá)載體pET-28a(+)上，并轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)突變蛋白，但是表達(dá)的蛋白大部分形成了包涵體，而且菌體破碎液離心后的上清液沒有檢測出木聚