人源N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(OGT)的原核表達(dá)及活性研究.pdf

1、O-GlcNAc是一種廣泛存在于蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸殘基上的一種動(dòng)態(tài)、可逆的蛋白翻譯后修飾,它主要分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中,參與調(diào)解許多細(xì)胞途徑。近年來的一些研究已經(jīng)證明O-GlcNAc的異常與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病等疾病相關(guān)。O-GlcNAc修飾是由O-連接N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(OGT)和O-連接N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)協(xié)同完成的,所以對(duì)OGT進(jìn)行深入研究意義重大。
　　 OGT是一個(gè)分子量比較大的蛋白,所以要在體外表達(dá)

2、OGT比較困難。利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,我們成功地將mOGT、ncOGT以及mOGT的截短型基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET-21a(+)上,獲得重組質(zhì)粒pET21/mOGT、pET21/ncOGT、pET21/mOGT(3TPR)和pET21/mOGT(5TPR),轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。我們?cè)诘蜏貤l件下誘導(dǎo)出了少量的mOGT,以及大量的mOGT(3TPR)和mOGT(5TPR)蛋白。依次用鎳柱親和層析和分子篩純化蛋白,我們

3、得到了純度高達(dá)85％的mOGT(5TPR)蛋白,并通過Wegem blot檢驗(yàn)到純化得到的蛋白具有OGT免疫學(xué)特異性。
　　 OGT蛋白含有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,氨基端的三十四肽重復(fù)序列(tetratricopeptiderepeat,TPR)和羧基端的催化結(jié)構(gòu)域。TPR結(jié)構(gòu)主要參與OGT的底物識(shí)別,不同長(zhǎng)度的TPR結(jié)構(gòu)具有不同的識(shí)別能力,有研究表明隨著TPR長(zhǎng)度的減少,其結(jié)合大分子底物的能力會(huì)減弱,但其對(duì)小分子多肽的結(jié)合能力會(huì)增加。

4、故我們就以人工合成的九肽為底物檢測(cè)了體外表達(dá)的mOGT(5TPR)蛋白的酶活。
　　 我們創(chuàng)新性的發(fā)展了一種檢測(cè)OGT活性的新方法:酶偶聯(lián)法。這種方法主要是通過檢測(cè)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中UDP的生成量來檢測(cè)OGT活性的。這種方法的主要原理是:UDP和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在丙酮酸激酶的作用下轉(zhuǎn)化成丙酮酸,然后通過商品化的丙酮酸檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)丙酮酸的生成量,在試劑盒的作用下丙酮酸會(huì)轉(zhuǎn)化成一種在570 nm處有紫外吸收的紅色產(chǎn)物,然后通

5、過沒標(biāo)儀讀取數(shù)值。通過對(duì)mOGT(5TPR)的進(jìn)行酶學(xué)常數(shù)研究,我們得到mOGT(5TPR)對(duì)L5DP-GlcNAc和九肽的Km值分別是0.17mM和0.16mM,說明OGT對(duì)UDP-GlcNAc和九肽有相同的親和力。并且OGT對(duì)UDP-GlcNAc的Km值與文獻(xiàn)報(bào)道的60μM在同一水平。
　　 總之,我們成功的構(gòu)建了OGT的原核表達(dá)菌株,并表達(dá)純化出高純度,具有一定活性的截短型OGT蛋白。隨后我們發(fā)展了一種檢測(cè)OGT活性的新方