海帶EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及TPS基因的克隆和比較遺傳學(xué)研究.pdf

1、海帶是重要大型經(jīng)濟(jì)海藻,也是我國人工栽培歷史最長和產(chǎn)量最高的海藻,我國海帶養(yǎng)殖面積、養(yǎng)殖產(chǎn)量均居世界首位。海帶廣泛應(yīng)用于食品保健、海洋藥物、化工原料、農(nóng)業(yè)肥料等方面,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,是我國海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。另外海帶生物量巨大,是近海潮下帶的重要初級生產(chǎn)力之一,對調(diào)節(jié)優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境具有重要的生態(tài)作用,其綜合利用和可持續(xù)發(fā)展越來越受重視。
　　 海帶生活史中典型的異型世代交替現(xiàn)象以及孤雌生殖和無配生殖現(xiàn)象,也使之成為藻類學(xué)和

2、遺傳學(xué)研究的良好模式生物。自海帶引入我國后,經(jīng)過幾十年的發(fā)展,其遺傳育種、育苗及栽培技術(shù)取得了很多進(jìn)展。與海帶栽培技術(shù)研究相比,目前有關(guān)海帶遺傳多樣性分析、經(jīng)濟(jì)性狀遺傳等應(yīng)用基礎(chǔ)研究還相對落后。
　　 由于海帶中多糖和酚類物質(zhì)含量較高、染色體數(shù)目眾多且基因組較大,海帶的分子遺傳學(xué)、基因研究及分子標(biāo)記工作進(jìn)展較為緩慢。目前,已公布的可直接應(yīng)用于遺傳性狀研究的分子標(biāo)記數(shù)量有限。在開發(fā)利用海帶資源的過程中,種質(zhì)問題也是是困擾其生產(chǎn)的一

3、個(gè)重大問題,本研究利用海帶EST數(shù)據(jù),進(jìn)行EST-SSR篩選、引物設(shè)計(jì)和驗(yàn)證應(yīng)用,進(jìn)行種質(zhì)遺傳多樣性分析。從4099條海帶屬EST中(其中971條來自我們構(gòu)建的兩個(gè)cDNA文庫,3128條從NCBI網(wǎng)站下載)篩選微衛(wèi)星位點(diǎn),設(shè)計(jì)合成63對引物,優(yōu)化反應(yīng)體系后,應(yīng)用于12個(gè)海帶屬材料分析,最終開發(fā)出23對EST-SSR引物,用這23對EST-SSR引物對12個(gè)海帶屬材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析,并能較好的將不同來源的樣品區(qū)分開來。這23對ES

4、T-SSR引物具有很好的實(shí)用性,可以用于海帶的分子生物學(xué)研究,特別是功能基因的研究。
　　 海藻糖是一種廣泛存在于自然界中的非還原性雙糖,研究表明它能提高植物抵抗溫度、pH等變化的能力,是一種前景廣闊的食品藥品穩(wěn)定劑、添加劑和植物抗逆保護(hù)劑。分離有關(guān)海藻糖合成酶的基因,應(yīng)用生物工程的手段引入植物,可以提高植物抗干旱、抗鹽堿的能力。本研究用同源克隆的方法,通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系,從海帶、裙帶菜、亨氏馬尾藻等海藻中克隆了海藻糖合成酶

5、基因TPS,其保守域長度為2727bp,并用生物信息學(xué)方法對已得到的海藻TPS基因的cDNA序列進(jìn)行了比較研究,發(fā)現(xiàn)它們之間的同源性都高于94.4％,海帶的TPS蛋白與其它各種海藻TPS蛋白的氨基酸序列同源性則都高于96.6％。將這些海藻TPS基因的DNA序列與已報(bào)道的其它幾種生物(大腸桿菌、釀酒酵母、擬南芥、水稻)的TPS基因的序列(EcOtsAB、ScTPS2、AtTPS5、OsTPS)進(jìn)行了比對,發(fā)現(xiàn)十種海藻TPS基因的序列是相對

6、保守的,這說明他們的功能應(yīng)該是相似的;其它幾種生物的TPS基因中,與海藻同源性最高的是水稻和擬南芥的TPS基因,它們之間的同源性達(dá)到40％以上,同源性次之的是酵母的TPS基因,它們之間的同源性只有27％左右:最低的是與大腸桿菌之間的同源性,它們的同源性僅僅只有20％左右。這與它們的進(jìn)化的等級是相同的。大腸桿菌為原核生物,在進(jìn)化樹的最低層,稍早于酵母的位置,所以與酵母的同源性最高,它們都在進(jìn)化樹的低層。而藻類和其他的高等植物在進(jìn)化樹的高層