牙鲆(Paralichthys olivaceus)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)基因的克隆和表達(dá)調(diào)控分析.pdf

1、在魚類和其它脊椎動(dòng)物中,胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)信號(hào)系統(tǒng)對(duì)于機(jī)體的生長(zhǎng)、代謝和繁殖有著非常重要的作用。該信號(hào)系統(tǒng)由兩個(gè)配體(IGF-I,IGF-II)、兩個(gè)受體(IGF-IR、IGF-IIR)和六個(gè)IGF結(jié)合蛋白(IGFBP1-6)組成。其中, IGFBPs不僅有依賴IGFs的作用,如調(diào)控IGFs的生物利用率、刺激或抑制IGFs的生物活性,還有不依賴IGFs的獨(dú)立作用,可以通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面受體或直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。在本

2、研究中,我們首先從健康牙鲆肝臟組織中克隆得到了牙鲆IGFBP-2a、-2b、-3和-4基因序列并進(jìn)行分析;利用熒光定量PCR技術(shù)分析了牙鲆四種IGFBPs基因的在成體組織中的分布和在不同發(fā)育時(shí)期的胚胎和仔魚中的表達(dá)差異;利用原代培養(yǎng)的牙鲆肝臟組織細(xì)胞研究了不同激素對(duì)牙鲆 IGFBP-3和 IGFBP-4基因的表達(dá)調(diào)控作用;最后克隆得到牙鲆四種IGFBPs基因的啟動(dòng)子序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。本研究的主要結(jié)果如下:
　　(1)本研

3、究克隆得到了牙鲆兩個(gè)IGFBP-2基因。其中IGFBP-2a基因cDNA長(zhǎng)1186bp,由42bp長(zhǎng)的5’UTR、861bp長(zhǎng)的ORF和283bp長(zhǎng)的3’UTR組成,編碼286個(gè)氨基酸前體,含有一個(gè)預(yù)測(cè)的26個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。而牙鲆IGFBP-2b基因cDNA長(zhǎng)1075bp,5’UTR、ORF和3’UTR的長(zhǎng)度分別為47bp、819bp和209bp。編碼248個(gè)氨基酸前體,含有一個(gè)預(yù)測(cè)的24個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。這兩個(gè)IGF

4、BP-2蛋白均含有18個(gè)保守的半胱氨酸殘基、2個(gè)保守的IGFBPs基序(GCGCCXXC和CWCV)、Arg-Gly-Asp(RGD)基序和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示牙鲆的IGFBP-2a和-2b基因位于IGFBP-2的不同分支,說(shuō)明它們起源于同一祖先基因并經(jīng)歷了魚類基因組的復(fù)制,是人類和其它哺乳動(dòng)物IGFBP-2的同源基因。qPCR顯示牙鲆IGFBP-2a和-2b基因在肝臟中表達(dá)量最高,但在其它外周組織中的表達(dá)存在

5、差異。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,IGFBP-2a的表達(dá)量明顯高于IGFBP-2b,而在孵化后IGFBP-2b表達(dá)量開始逐漸上升,并超過(guò) IGFBP-2a。這說(shuō)明 IGFBP-2a主要參與了早期的胚胎發(fā)育,而IGFBP-2b在仔魚的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。
　　(2)牙鲆IGFBP-3基因的cDNA全長(zhǎng)為1060bp,ORF為861bp,含有一個(gè)102bp長(zhǎng)的5’UTR和一個(gè)97bp長(zhǎng)的3’UTR。ORF編碼286個(gè)氨基酸殘基,并包含

6、一個(gè)22個(gè)氨基酸殘基的預(yù)測(cè)信號(hào)肽。牙鲆IGFBP-3蛋白含有18個(gè)半胱氨酸殘基和2個(gè)典型的IGFBPs基序(GCGCCXXC和CWCV)。同時(shí),該蛋白還存在核定位序列(NLS)、肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)和金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)。牙鲆IGFBP-3基因全長(zhǎng)15223bp,包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析都表明牙鲆的IGFBP-3基因是魚類IGFBP-3家族成員。qPCR結(jié)果顯示牙鲆IGFBP-3在所有成體組織中都能被

7、檢測(cè)到,在精巢和卵巢中最豐富。此外,在牙鲆胚胎發(fā)育過(guò)程中均存在IGFBP-3的表達(dá),且在孵化后7d的仔魚中表達(dá)量相對(duì)較低,而在變態(tài)期間顯著上升。這表明牙鲆IGFBP-3通過(guò)調(diào)控IGFs活性對(duì)魚類早期的生長(zhǎng)和發(fā)育有非常重要的作用。
　　(3)牙鲆IGFBP-4基因cDNA序列全長(zhǎng)為1493bp,包含一個(gè)552bp長(zhǎng)的5’UTR和一個(gè)161bp長(zhǎng)的3’UTR。其完整的ORF長(zhǎng)780bp,預(yù)測(cè)編碼259個(gè)氨基酸殘基的前體,含28個(gè)氨基酸

8、殘基組成的信號(hào)肽。在牙鲆IGFBP-4蛋白的N-和C-端結(jié)構(gòu)域中含有20個(gè)保守的半胱氨酸殘基和2個(gè)典型的 IGFBPs基序(GCGCCXXC和CWCV)。牙鲆IGFBP-4基因全長(zhǎng)13414bp,包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析都表明牙鲆的 IGFBP-4基因是哺乳動(dòng)物IGFBP-4基因的同源基因。qPCR結(jié)果顯示牙鲆IGFBP-4在成體各組織中均有分布,在腸中表達(dá)量最高。在早期胚胎和仔魚發(fā)育過(guò)程中,牙鲆 IGFBP-

9、4均有不同程度的表達(dá)。在孵化后3d和15d的仔魚中表達(dá)量增高,而在變態(tài)期逐漸降低。這表明 IGFBP-4參與了牙鲆的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,并受到營(yíng)養(yǎng)狀況的調(diào)控。此外,利用pET-32a(+)原核表達(dá)載體構(gòu)建了含牙鲆IGFBP-4成熟肽的重組質(zhì)粒。使用BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞成功表達(dá)了牙鲆IGFBP-4成熟肽蛋白,其以可溶性蛋白形式存在,最佳培養(yǎng)條件為20℃連續(xù)培養(yǎng)6h。
　　(4)在體外原代培養(yǎng)的牙鲆肝臟組織細(xì)胞中,10nM

10、和100nM濃度的GH均能顯著增加牙鲆IGFBP-4的表達(dá)。當(dāng)用10nM的GH處理肝細(xì)胞時(shí),在處理6h后IGFBP-4的表達(dá)量就開始上升并隨著處理時(shí)間的延續(xù)維持相對(duì)較高水平。不同濃度的胰島素可以降低原代培養(yǎng)的牙鲆肝細(xì)胞中的 IGFBP-4的表達(dá)量。當(dāng)培養(yǎng)基中的胰島素濃度為10μM,在處理6~48h后均引起IGFBP-4表達(dá)量的持續(xù)下降。不同濃度的IGF-I和IGF-II對(duì)肝細(xì)胞中IGFBP-4表達(dá)量的影響呈現(xiàn)連續(xù)波動(dòng)趨勢(shì)。而10ng/μ

11、l的IGF-I可以使IGFBP-4的表達(dá)量顯著下降。另外,不同濃度的GH和胰島素以及高濃度的 IGF-I和 IGF-II都會(huì)增加原代培養(yǎng)的牙鲆肝細(xì)胞中IGFBP-3的表達(dá)量。在時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,10nM的GH使IGFBP-3的表達(dá)量在處理后48h達(dá)到最大值;而10μM的胰島素和100ng/μl的IGF-I使IGFBP-3的表達(dá)量先增加后降低。
　　(5)利用染色體步移的方法克隆得到了牙鲆IGFBP-2a、-2b、-3和-4基因的啟動(dòng)

12、子序列,分別長(zhǎng)為2145bp、1638bp、1811bp和2753bp。利用不同的在線網(wǎng)站分析預(yù)測(cè)了各啟動(dòng)子區(qū)存在的潛在順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在牙鲆IGFBP-3和-4轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-30bp處,均含有一個(gè)典型的TATA box,而在 IGFBP-2a和-2b基因中沒有發(fā)現(xiàn) TATA box的存在。在四種牙鲆 IGFBPs的啟動(dòng)子區(qū)中均發(fā)現(xiàn) C/EBP、CREB、GATA、HNF、Pit-1、Oct-1、RXR、GR