microRNA-449b對膿毒癥小鼠高遷移率族蛋白B1介導(dǎo)樹突狀細胞免疫功能障礙的影響.pdf

1、目的：探討miR-449b在高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）調(diào)控樹突狀細胞（dendritic cell, DC）免疫效應(yīng)中的作用及其對膿毒癥小鼠免疫功能障礙的影響。
　　方法：1 HMGB1分別以10、100、1000 ng/ml劑量刺激正常小鼠脾臟來源的CD11c+ DC，并分別于24 h、48 h及72 h檢測DC表面標志物及共刺激分子（CD80、CD86

2、、MHC-II）、細胞因子分泌（IL-12、IL-10）以及 DC凋亡的改變；并用 QPCR檢測12 h、24 h、48 h細胞內(nèi) miR-449b改變。2 DC轉(zhuǎn)染 miR-449b模擬物（ miR-449b）、抑制物（ In-miR-449b）及相應(yīng)對照（miR-NC、In-miR-NC）后，HMGB1（100 ng/ml）刺激48 h收取細胞，檢測 DC表面分子、細胞因子（IL-12、IL-10）、凋亡改變以及與T細胞混合培養(yǎng)后T

3、細胞增殖、分化功能的變化；進一步應(yīng)用miRNA相關(guān)預(yù)測軟件及結(jié)合相關(guān)文獻確定 miR-449b介導(dǎo)這一過程中的潛在靶蛋白 Notch1和Sirt1，并用 western blot研究 miR-449b對靶蛋白的影響。3復(fù)制小鼠 CLP模型，術(shù)后48h及120h分別通過尾靜脈注射 miR-449b antagomir及對照（8mg/kg，300ul），觀測膿毒癥小鼠10天生存率。此外于術(shù)后第7天通過腹腔注射 LPS（10ug/只）給予二次

4、打擊，在6h后檢測各組小鼠血清中 IL-12及IL-10水平、脾臟中成熟DC所占比例以及脾臟DC表面分子表達、凋亡率及其對 CD4+T細胞增殖分化的影響。
　　結(jié)果：1 HMGB1刺激 DC后，其表面分子及細胞因子IL-12隨著時間及劑量的增加表達上調(diào)，其中以48 h、100 ng/ml組上調(diào)最為明顯，而大劑量（1000 ng/ml）時及72 h組表達有所下調(diào)；隨著HMGB1劑量及刺激時間的增加，DC凋亡率升高，細胞因子 IL-1

5、0分泌增加（P<0.05）；miR-449b在12 h及24 h組表達下調(diào)，100及1000 ng/ml組在48 h表達明顯上調(diào)（P<0.05）。2轉(zhuǎn)染 miR-449b可上調(diào)其在細胞內(nèi)表達，而抑制物可抑制其表達；上調(diào)miR-449b后HMGB1（100 ng/ml）刺激48 h DC表面分子CD86表達顯著上調(diào)（P<0.05）、凋亡增加（P<0.01）、細胞因子 IL-10分泌增多（P<0.05），對 T細胞的共刺激增殖效應(yīng)減弱及混合

6、性淋巴細胞反應(yīng)中 IL-4水平增多（P<0.01）、IFN-γ水平下降（P<0.05）；miR-449b的過表達可抑制靶蛋白Notch1及Sirt1的表達。3抑制miR-449b能明顯改善晚期膿毒癥小鼠的病死率，進一步研究發(fā)現(xiàn)抑制 miR-449b的表達能明顯增加晚期膿毒癥小鼠血清中 IL-12的水平（P<0.05）、樹突狀細胞在脾臟中的比例（P<0.01）和表面分子 MHC-II（P<0.05）、CD80（P<0.05）的表達以及減少

7、凋亡（P<0.05）和血清中IL-10的水平（P<0.05），促進T細胞的增殖(P<0.05)及向功能性Th1極化；miR-449b antagomir組靶蛋白Notch1及Sirt1有所上調(diào)。
　　結(jié)論：HMGB1介導(dǎo)小鼠脾臟DC成熟分化過程中miR-449b起重要的負性調(diào)控作用，并明顯促進HMGB1刺激誘導(dǎo)的 DC凋亡；抑制 miR-449b表達水平可有效改善膿毒癥小鼠病死率及脾臟 DC的免疫功能狀態(tài)，可能是緩解機體免疫功能障