TXNIP敲除對糖尿病小鼠腎損傷的影響及機制研究.pdf

1、目的：糖尿病腎疾?。╠iabetic kidney disease, DKD）是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是引起終末期慢性腎臟疾病（chronic kidney disease, CKD）的主要原因。腎小管損傷是糖尿病腎疾病進(jìn)程中的重要病理變化。關(guān)于預(yù)防和延緩糖尿病腎疾病的發(fā)生發(fā)展，保護(hù)腎功能，治療糖尿病腎疾病等方面仍然需要進(jìn)一步的研究。
　　已有研究證實，糖尿病時，腎臟中存在大量的活性氧簇（ reactive oxygen s

2、pecies, ROS）蓄積，破壞腎臟氧化還原的動態(tài)平衡，造成腎組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而引起腎損傷的發(fā)生發(fā)展。體內(nèi)存在多種抗氧化系統(tǒng)清除ROS，如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及維生素C等可修復(fù)氧化損傷。阻止ROS的過量蓄積已成為治療糖尿病腎疾病的有效途徑。
　　硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）系統(tǒng)在對抗氧化應(yīng)激方面起重要作用。TRX是一種巰基-氧化還原酶，能夠還原被氧化的蛋白，同時其自身的半胱氨酸殘基被氧化，此后，TRX

3、又被 NADPH依賴的硫氧還蛋白還原酶催化還原。這種作用維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的還原狀態(tài)使其發(fā)揮正常功能。硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interaction protein，TXNIP）又稱硫氧還蛋白結(jié)合蛋白-2（thioredoxin binding protein-2，TBP-2）和維生素D3上調(diào)蛋白1（vitamin D3-upregulated protein1，VDUP-1）。TXNIP是TRX的內(nèi)源性抑制蛋白，

4、TXNIP與TRX活性位點結(jié)合而抑制TRX活性，間接調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)并且可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。
　　許多研究表明，TXNIP在糖尿病相關(guān)模型中表達(dá)均明顯升高。敲低或敲除TXNIP可抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。TXNIP在葡萄糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用。敲低TXNIP表達(dá)能夠抑制高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的凋亡。我們前期研究顯示：高糖能夠誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞和腎小管細(xì)胞中TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，并且p3

5、8 MAPK信號通路參與了此過程；敲低TXNIP表達(dá)能夠增加高糖條件下細(xì)胞TRX活性和減少細(xì)胞內(nèi)ROS含量，同時抑制p38 MAPK和ERK1/2等信號的激活。以上研究提示：TXNIP可能在DKD發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。
　　在本研究中我們采用野生型C57BL/6（Wild type, WT）小鼠和TXNIP基因敲除鼠(TXNIP knockout, TKO)進(jìn)行實驗，利用STZ誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，觀察了 TXNIP在糖尿病腎臟損

6、傷中的作用以及作用機制，驗證TXNIP能否成為糖尿病腎疾病治療的新靶點。
　　方法：
　　動物實驗
　　6~8周齡雄性WT小鼠(C57BL/6)和TKO小鼠(C57BL/6背景)隨機分為四組：WT對照組、WT+DM模型組、TKO+DM模型組、TKO對照組，每組8只。糖尿病模型建立采用多次小劑量STZ（50 mg/kg，溶于pH4.5檸檬酸緩沖液）腹腔注射誘導(dǎo)建立小鼠Ⅰ型糖尿病模型。給藥前小鼠禁食12小時，連續(xù)給藥5天。

7、給藥3天后測血糖，凡全血血糖≥16.7mmol/L，尿糖++～+++者確定為糖尿病模型。實驗期間兩周檢測一次血糖、體重。
　　于造模成功后24周進(jìn)行取材，收集血液及24小時尿液，用于生化指標(biāo)檢測。小鼠稱重后進(jìn)行取材，取部分腎組織放于4％多聚甲醛溶液中固定，用于組織切片制作，進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)染色，免疫熒光染色和TUNEL染色檢測。取部分腎皮質(zhì)組織置于2.5%戊二醛固定，用于電子顯微鏡觀察。取部分腎皮質(zhì)組織置于液氮用于

8、提取總RNA和總蛋白，觀察腎皮質(zhì)中相關(guān)檢測指標(biāo)的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎組織TXNIP的影響。
　　與WT對照組相比，DM組小鼠腎組織中TXNIP表達(dá)明顯增高；與WT+DM組比較，TKO+DM組和TKO組小鼠腎臟中TXNIP表達(dá)缺失，這說明TXNIP敲除成功并且TXNIP敲除可改善糖尿病誘導(dǎo)的TXNIP過度表達(dá)。
　　2敲除TXNIP改善糖尿病小鼠的一般情況。

9、>　　通過檢測與糖尿病腎病相關(guān)的常用生化指標(biāo)顯示：與 WT對照組相比，WT+DM小鼠體重減輕，血糖和24h尿蛋白高于正常。TXNIP敲除對DM小鼠的上述指標(biāo)有所改善。
　　3敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎臟病理變化的影響。
　　腎小球光鏡 PAS染色和 MASSON染色發(fā)現(xiàn)，與 WT對照組相比， WT+DM組系膜區(qū)明顯增寬，細(xì)胞外基質(zhì)增多，部分腎小球毛細(xì)血管腔擴(kuò)張。敲除TXNIP基因能夠改善上述糖尿病引起的腎病變。電鏡觀察顯示

10、：WT+DM組腎小球部分足突融合消失，基底膜不規(guī)則增厚，系膜區(qū)增寬。與對照相比，ColΙ在WT+DM組腎小球表達(dá)明顯增高，TXNIP敲除能夠改善糖尿病誘導(dǎo)的ColΙ過度表達(dá)。
　　4敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎臟凋亡及凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響。
　　TUNEL法檢測結(jié)果顯示：與WT對照組相比，WT+DM組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增高；與WT+DM組比較，TKO+DM組腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。與 WT對照組相比， WT+DM組

11、小鼠腎組織中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase-3水平明顯增高；與WT+DM組比較，TKO+DM組Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase3明顯降低，這說明TXNIP敲除可以改善DM小鼠腎臟細(xì)胞的凋亡。
　　5敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎組織α-SMA表達(dá)的影響。
　　與WT對照組相比，WT+DM組小鼠腎組織中α-SMA表達(dá)明顯增高；與WT+DM組比較，TKO

12、+DM組小鼠中α-SMA表達(dá)明顯降低，這說明TXNIP敲除可以明顯降低DM小鼠腎臟中α-SMA水平。
　　6敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響。
　　與WT對照組相比，WT+DM組小鼠腎組織中Nox4和尿中8-OHdG表達(dá)明顯增高；與WT+DM組比較，TKO+DM組腎組織中Nox4和尿中8-OHdG表達(dá)明顯降低，這說明TXNIP敲除可以明顯降低DM小鼠腎臟中氧化應(yīng)激水平。
　　7敲除TXNIP對糖尿病小鼠腎臟

13、p38 MAPK和ERK1/2信號通路激活的影響。
　　與WT對照組相比，WT+DM組小鼠腎組織中p38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平明顯增高；與WT+DM組比較，TKO+DM組小鼠腎組織中p38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、在糖尿病小鼠腎臟中TXNIP表達(dá)明顯增加。
　　2、敲除TXNIP能夠保護(hù)糖尿病小鼠腎功能，改善腎臟肥大和腎小管間質(zhì)纖維化。
　　3、敲除TXN