重組人表皮生長因子的表達純化及其凝膠劑的制備.pdf

1、南開大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)書 本人完全了解《南開大學(xué)關(guān)于研究生學(xué)位論文收藏和利用管理辦法》關(guān)于南開大學(xué)(簡稱“學(xué)?！?研究生學(xué)位論文收藏和利用的管理規(guī)定，同意向南開大學(xué)提交本人的學(xué)位論文電子版及相應(yīng)的紙質(zhì)本，并委托印刷存檔論文。 本人了解南開大學(xué)擁有在《中華人民共和國著作權(quán)法》規(guī)定范圍內(nèi)的學(xué)位論文使用權(quán)，同意在以下幾方面向?qū)W校授權(quán)。即： 1.學(xué)校將學(xué)位論文編入《南開大學(xué)博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并作為資料在學(xué)校圖書館等場所提供閱覽，在校

2、園網(wǎng)上提供論文目錄檢索、文摘以及論文全文瀏覽、下載等信息服務(wù)； 2.學(xué)?？梢圆捎糜坝?、縮印或其他復(fù)制手段保存學(xué)位論文；學(xué)校根據(jù)規(guī)定向教育部指定的收藏和存檔單位提交學(xué)位論文； 3.非公開學(xué)位論文在解密后的使用權(quán)同公開論文。 4.同意學(xué)校將本人向有關(guān)電子出版單位授權(quán)的學(xué)位論文(含電子版和授權(quán)書)轉(zhuǎn)交相關(guān)授權(quán)單位。 本人承諾：本人的學(xué)位論文是在南開大學(xué)學(xué)習(xí)期間創(chuàng)作完成的作品，并已通過論文答辯；提交的學(xué)位論文電子版與紙質(zhì)本論文的內(nèi)容一致，如因不

3、同造成不良后果由本人自負。 本人簽署本授權(quán)書一份，交圖書館留存。 學(xué)位論文作者暨授權(quán)人(親筆)簽字： 葛令苗 2015 年 5 月 26 日 南開大學(xué)研究生學(xué)位論文作者信息 論 文 題 目 論 文 題 目 重組人表皮生長因子的表達純化及其凝膠劑的制備 重組人表皮生長因子的表達純化及其凝膠劑的制備 姓 名 姓 名 葛令苗 葛令苗 學(xué)號 學(xué)號 2120120961 2120120961 答 辯 日

4、 期 答 辯 日 期 2 0 1 5 2 0 1 5 年 5 5 月 2 0 2 0 日 論 文 類 別 論 文 類 別 博士 博士 □ 學(xué)歷碩士 學(xué)歷碩士 √ 專業(yè)學(xué)位碩士 專業(yè)學(xué)位碩士 □ 同等學(xué)力碩士 同等學(xué)力碩士 □ 劃 √ 選 擇 選 擇 學(xué) 院 學(xué) 院 ( 單 位 單 位 ) 生命科學(xué)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 學(xué) 科 學(xué) 科 / 專 業(yè) 專 業(yè) ( 專 業(yè) 學(xué) 位 專 業(yè) 學(xué) 位

5、 ) 名 稱 名 稱 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 聯(lián) 系 電 話 聯(lián) 系 電 話 13821352729 13821352729 電 子 郵 箱 電 子 郵 箱 gelingmiao@163.com gelingmiao@163.com 通信地址 通信地址(郵編 郵編)： 天津市南開區(qū)衛(wèi)津路 天津市南開區(qū)衛(wèi)津路 94 94 號 南開大學(xué)（ 南開大學(xué)（300071 300071） 非 公 開 論 文 編 號 非 公 開

6、 論 文 編 號 備 注 備 注 注：本授權(quán)書適用我校授予的所有博士、碩士的學(xué)位論文。由作者填寫一份并簽字后交校圖書館，如已批準為非公開學(xué)位論文，須附批準通過的《南開大學(xué)研究生申請非公開學(xué)位論文審批表》和“非公開學(xué)位論文標注說明”頁。 摘要 I 摘要 摘要 表皮生長因子 （表皮， 生長因子， EGF） 是一種低分子量的多肽類細胞因子，能促進機體多種細胞的增殖；對治療角膜損傷、神經(jīng)損傷，加快胃腸道潰瘍和體表創(chuàng)傷的愈合都有很高的臨床應(yīng)用

7、價值；研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞中的表皮生長因子異常增加，因而 EGF 也可以作為抗腫瘤的靶點；在化妝品領(lǐng)域，添加了EGF 的化妝品可以促進膠原蛋白的合成，活化皮膚細胞，對延緩細胞衰老起到很好的效果。 為了簡單高效的獲得 EGF，本論文設(shè)計并實施了創(chuàng)新的融合表達與純化策略。 首先本文人工合成編碼 EGF 的基因， 并在其前端加入編碼 DDDDK 序列 （腸激酶識別位點：-(Asp)4-Lys-） ，插入到 pET-GST-3C 載體上，獲得大

8、腸桿菌 EGF融合表達系統(tǒng)。經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達，高壓破碎菌體，包涵體復(fù)性，EGF 融合蛋白GST 親和層析純化，腸激酶切去標簽蛋白，并進一步經(jīng)過 10 kD 的超濾膜分離純化獲得 EGF 粗品。最后再經(jīng) HPLC 分離制備 EGF，純度高達 95.41%。經(jīng)過蛋白電泳鑒定為 6.0 kD， 與預(yù)期一致。 紫外光譜掃描儀掃描， 最大吸收峰在 270 nm。經(jīng)計算，重組 EGF 的產(chǎn)量為 53.056 mg/L。 其次，鑒于腸激酶切割融

9、合蛋白具有高度專一性和切割效率高的優(yōu)點，本文優(yōu)化了畢赤酵母分泌表達腸激酶的條件： 甲醇濃度為 1.5 %、 誘導(dǎo)溫度為 27 ℃、誘導(dǎo)時間為 100 h， 得到腸激酶的酶活為 30.10 IU/mL。 經(jīng)計算一個酶活單位最終酶切 2.28 μgEGF 融合蛋白。 凝膠劑生物相容性優(yōu)良， 能發(fā)揮持續(xù)的藥物釋放效果。 最后本文優(yōu)化了 EGF凝膠劑的成分配方， 其最佳計量為焦亞硫酸鈉 0.10 g， 乙二胺四乙酸二鈉 0.01 g，甘油 5

10、g， 卡波姆基質(zhì) 1.00 g 溶脹、 三乙醇胺約 1.35 g 中和成透明凝膠、 加入 2 mL含有 1.0 mgEGF 的溶液，攪拌均勻后加注射用水至 100 g。所制備的凝膠劑可以成功釋放 EGF，能促進小鼠胚胎成纖維細胞（Balb/c3T3）的增殖，經(jīng)測定生物活性為 6.32 x 105 IU（1.0 mg）/100g。 國內(nèi)關(guān)于 EGF 的研究， 大多是融合表達重組 EGF， 對獲得 EGF 融合表達純化的報道較少，加之市場上