假交替單胞菌淀粉酶和瓊脂酶基因的克隆、表達及其特性鑒定.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文假交替單胞菌淀粉酶和瓊脂酶基因的克隆、表達及其特性鑒定姓名：陶雪瑩申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導教師：喻子牛;李泳春20080601假交替學．胞菌淀粉酶和瓊脂酶甚I 大I 的克降、表達及J e 特他攀定A b s t r a c tG l y c o s i d a s e sc a t a l y z et h e h y d r o l y s i so f t h eg l y c o s i d i

2、 c l i n k a g e ．a(chǎn) - A m y l a s e sa r ec l a s s i f i e d嬲f a m i l y 13 o ft h e g l y c o s i d a s e s ；t h e y a r ea m o n gt h em o s ti m p o r t a n t c o m m o l e r c i a le f l z y m o s ，h a v e w i d ea

3、p p l i c a t i o n s i n s t a r c hp r o c e s s i n g ，b r e w i n g , a l c o h o l p r o d u c t i o n ,t e x t i l e ，d e t e r g e n ta n do t h e ri n d u s t r i e s ．A g a r a s e s ，c a t a l y z i n g t h eh

4、y d r o l y s i so fa g a r ，a r ec h a r a c t e r i z e d a s 0 【- a g a r a s e s ，1 3 - a g a r a s e s ；1 3 - a g a r a s e sp r o d u c en e o a g a r o o l i g o s a c c h a r i d e sw h i c hh a v ep o t e n t i

5、a l a p p l i c a t i o n s f o rt h ef o o d ，c o s m e t i c ，p h a r m a c e u t i c a l a n dm e d i c a li n d u s t r i e s 。I nt h i s s t u d y ，t w og l y c o s i d a s eg e n e sw e r ec l o n e d f r o mP s e

6、u d o a l t e r o m o n a ss p e c i e s ；t h e y w e r e e x p r e s s e d a n d c h a r a c t e r i z e d ．Ag e n e ( a m y A ) e n c o d i n g a l l e x t r a c e l l u l a r a - a m y l a s e f r o m m a r i n e b a

7、c t e r i u m ，P s e u d o a l t e r o m o n a s s p ．M Y - 1 ，W a s c l o n e d a n d e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i ．I tc o m p r i s e d a i lo p e n r e a d i n gf r a m e o f 2 ，0 0 7b a s e p a

8、 i r sa n d e n c o d e s a p r o t e i no f 6 6 8 a m i n oa c i d sw i t ha p r e d i c t e dm o l e c u l a rw d g h t o f 7 4d a l t o n sa n d a p Io f 5 ．15 ．T h e e n t i r ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f a m

9、y A g e n es h o w e d8 6 ％s i m i l a r i t y t ot h ea ·a m y l a s e p r e p r o p r o t e i n f r o mP s e u d o a l t e r o m o n a s h a l o p l a n k t i s ．Rc o n s i s t s o fa s i g n a l p e p t i d e ，G

10、t - a m y l a s e c a t a l y t i cd o m a i na n d a nA m y _ C d o m a i n ．T h er e c o m b i n a n ta m y l a s eW a s p u r i f i e dt oh o m o g e n e i t ya n d b i o c h e m i c a l l yc h a r a c t e r i z e d ．

11、T h ee n z y m er e v e a l e dm a x i m u m a c t i v i t y a tp H 7 ．0 a n d4 0 。C ．T h ee n z y m e h y d r o l y z e ds o l u b l es t a r c ha n d s o m em a l t o o l i g o s a c c h a r i d e st o s e v e r a lo l

12、 i g o s a c c h a r i d e s ，a n d m a l t o s ew a s t h ec o m m o l o n p r o d u c tf r o md i f f e r e n ts u b s t r a t e s ．T h er e s u l t s a l s os u g g e s t t h a tC a + p l a y si m p o r t a n tr o l e

13、 s i na - a m y l a s e ．A g e n e ( a g a A 6 ) e n c o d i n g a ne x t r a c e l l u l a r a g a r a s ef r o m P s e u d o a l t e r o m o n a s s p ．J T - 6 ，W a sc l o n e d ，s e q u e n c e da n d e x p r e s s e

14、di nE s c h e r i c h i a c o l i ．I tc o m p r i s e d a no p e n r e a d i n g f r a m eo f1 , 3 3 8b a s ep a i r sa n d e n c o d e s a p r o t e i no f 4 4 5a m i n o a c i d sw i t ha p r e d i c t e dm o l e c u l

15、 a rw e i g h to f 5 0d a l t o n s ．T h ee n t i r ea m i n o a c i ds e q u e n c eo f t h i s a g a r a s eg e n es h o w e d9 9 ％i d e n t i t yw i mt h ea g a Ag e n ef r o mJ a n t h i n o b a c t e r i u ms p ．S Y

16、 l 2 ．I t c o n s i s t so fas i g n a lp e p t i d e ，ag l y c o s i d eh y d r o l a s e f a m i l y 1 6 p - a g a r a s ed o m a i na n d ac a r b o h y d r a t e - b i n d i n gd o m a i n ．T h er e c o m b i n a n t

17、 a g a r a s e W a so v e r e x p r e s s e d a n d p u r i f i e d t o h o m o g e n e i t y ．E n z y m e a c t i v i t ya n a l y s i sr e v e a l e dt h a t t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ea n dp H f o rt h ep

18、 u r i f i e dr e c o m b i n a n te n z y m e w e r e a r o u n d4 0 “ Ca n d9 ．0 ．T h ee n z y m ew a s a ne n d o —t y p e1 3 - a g a r a s ea n d h y d r o l y z e da g a r o s e t os e v e r a l o l i g o s a c c h