新型豬胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、為構(gòu)建高效促動(dòng)物生長(zhǎng)基因，探索研制新型促動(dòng)物生長(zhǎng)制劑。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用重疊區(qū)基因拼接法(Gene Splice by Overlap Extension，GSOE)對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因加以改造。在其N(xiāo)端引入BamHI的酶切位點(diǎn)，C端引入BglⅡ和EcoRI酶切位點(diǎn)以及終止密碼子，并在酶切位點(diǎn)之前添加保護(hù)性堿基。去除了N端四個(gè)末端氨基酸(Gly-Pro-Glu-Thr) 以及中間 C區(qū)Gly-Set-Ser-Ser-Arg-Arg-Al

2、a部分序列，保留其活性部位。克隆PCR產(chǎn)物于pMD18一T載體上測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物大小為205bp，編碼59個(gè)氨基酸，與目的片段大小一致。將測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物構(gòu)建了pGEX-4T-1-IGF-1D原核表達(dá)載體。經(jīng)BamHI和EcoRI酶切及質(zhì)粒PCR鑒定，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的新型胰島素樣生長(zhǎng)因子基因-1已克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，為進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)表達(dá)條件及生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 將已構(gòu)建的pGEX-4

3、T-1-IGF-1D蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用2×YTA培養(yǎng)基培養(yǎng)，以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，作SDS-PAGE分析表達(dá)情況。結(jié)果顯示，表達(dá)蛋白分子量約為33kDa，與預(yù)期目標(biāo)帶大小一致。將誘導(dǎo)條件經(jīng)過(guò)溫度梯度、時(shí)間梯度以及IPTG濃度梯度的分析選擇進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)優(yōu)化原核誘導(dǎo)表達(dá)條件，發(fā)現(xiàn)pGEX-4T-1-IGF-1D蛋白在37℃，IPTG終濃度為0.5mM的條件下誘導(dǎo)4小時(shí)，蛋白表達(dá)效果較佳。 將