酸酐類雙功能試劑修飾輔助的蛋白質(zhì)組研究新方法及其應(yīng)用.pdf

1、本論文針對目前定量蛋白質(zhì)組研究方法不完善，定量試劑盒價格昂貴，試劑合成困難和完全依靠進(jìn)口、無自主知識產(chǎn)權(quán)的研究現(xiàn)狀，發(fā)展和建立了一系列基于酸酐雙功能試劑修飾輔助的蛋白質(zhì)組學(xué)研究新方法。 論文第一部分建立了酸酐類雙功能試劑螯合稀土金屬元素標(biāo)記的生物質(zhì)譜檢測定量蛋白質(zhì)組新方法。在該方法中，創(chuàng)新性地將價廉易得的雙功能試劑二乙三胺五乙酸(DTPA)雙酸酐偶合到蛋白質(zhì)肽段的伯氨基，然后利用該試劑的螯合作用分別結(jié)合化學(xué)與物理性質(zhì)極其接近的

2、稀土金屬元素，作為生物質(zhì)譜檢測中的質(zhì)量標(biāo)簽，建立了蛋白質(zhì)組相對定量的新方法。該方法與目前的蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法相比，具有普遍標(biāo)記、沒有肽段歧視、試劑價格低廉容易獲得、被標(biāo)記的肽段在二級質(zhì)譜裂解中能夠產(chǎn)生連續(xù)的y系列離子，可以提高鑒定的可靠性等優(yōu)點。該方法相關(guān)的研究內(nèi)容已經(jīng)發(fā)表在國際期刊Analytical Chemistry(2006，78，6614-6621)。 論文第二部分針對蛋白質(zhì)組定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性的問題，建立了一

3、種基于酸酐類雙功能試劑修飾輔助的，結(jié)合穩(wěn)定同位素<'18>O標(biāo)記，生物質(zhì)譜檢測的雙重定量新策略。該雙重定量策略包括了兩種定量標(biāo)記方法，即化學(xué)<'18>O標(biāo)記方法和化學(xué)與酶切結(jié)合的<'18>O標(biāo)記方法。化學(xué)<'18>O標(biāo)記方法與傳統(tǒng)的<'18>O標(biāo)記方法相比，不存在<'18>O到<'16>O原子的回交現(xiàn)象；化學(xué)與酶切結(jié)合的標(biāo)記方法避免了同位素峰的重疊現(xiàn)象，兩種標(biāo)記方法獲得的定量結(jié)果可以相互驗證，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且兩種標(biāo)記方法中只需要

4、一次的樣品制備，既節(jié)省了樣品制備過程中的人力物力，又減小了樣品制備過程中帶來的誤差。 論文的第三部分利用釀酒酵母為研究對象，將本論文第二部分建立的<'18>O雙重定量策略應(yīng)用于實際的生物樣本分析，對方法在實際樣本應(yīng)用中的可行性進(jìn)行了全面的考查，對該定量策略的定量準(zhǔn)確性和可靠性做了進(jìn)一步的評價，并研究了酵母在敲除與不敲除YHB1基因的差異蛋白質(zhì)組中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，對差異蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行了初步的探討。 論文的第四部分針

5、對敲除YHB1基因的釀酒酵母在NO刺激與不刺激兩種培養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，用<'18>O雙重定量策略尋找表達(dá)量發(fā)生上調(diào)和下調(diào)的差異蛋白質(zhì)，并且對其生物功能和相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行了初步的討論，加深了對NO相關(guān)的信號傳遞途徑和生物學(xué)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識。 本論文的最后一部分針對目前蛋白質(zhì)組研究面臨的生物樣本肽段混合物高度復(fù)雜、蛋白質(zhì)末端信息難以獲得和質(zhì)譜鑒定可信度低等問題，通過化學(xué)修飾輔助的酸酐類雙功能試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)的N端，離子交