葉綠體基因工程與植物細(xì)胞器基因組進(jìn)化研究.pdf

1、植物細(xì)胞中，除了細(xì)胞核中具有遺傳物質(zhì)DNA之外，葉綠體和線粒體也擁有半自主性的能自我復(fù)制和遺傳的基因組。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的植物核基因組、葉綠體基因組和線粒體基因組相繼完成了測(cè)序。研究發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組和線粒體基因組結(jié)構(gòu)和序列信息在揭示物種起源、進(jìn)化演變及其不同物種之間的親緣關(guān)系等方面具有重要價(jià)值；與此同時(shí)，比核轉(zhuǎn)化具有明顯優(yōu)勢(shì)的葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在遺傳改良、生物制劑的生產(chǎn)等方面顯示出巨大潛力，使得葉綠體基因工程成為植物基因工

2、程中發(fā)展的新領(lǐng)域。葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和序列分析則是葉綠體基因工程的基礎(chǔ)，而葉綠體基因工程研究又為細(xì)胞器與核基因組之間的基因轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)的協(xié)調(diào)作用機(jī)制等研究提供實(shí)踐證明，對(duì)研究植物的進(jìn)化起源有重要的意義。葉綠體基因工程技術(shù)也隨著葉綠體測(cè)序的完成逐漸成為轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)整合、多拷貝高效表達(dá)外源基因，培育優(yōu)良性狀農(nóng)作物品種和作為生物反應(yīng)器合成目的蛋白的熱門選擇。本研究以小麥葉綠體基因組中的atpB和rbcL 作為同源重組片段，用nptII和gfp分

3、別作為篩選基因和標(biāo)記基因，構(gòu)建小麥葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體，用基因槍轟擊法分別轉(zhuǎn)化小麥的幼胚盾片和幼穗段。對(duì)T0代再生植株進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證，PCR和Southern blot結(jié)果證實(shí)標(biāo)記基因gfp已經(jīng)成功整合到葉綠體基因組中，并得到了同質(zhì)化的再生植株。用T1代植株的葉片檢測(cè)到GFP綠色熒光在葉綠體中表達(dá)，證明已經(jīng)成功建立了小麥葉綠體穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系。應(yīng)用植物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白或疫苗等也成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，本研究用農(nóng)桿菌浸染煙

4、草葉片的方法將人干擾素α-2b基因轉(zhuǎn)入煙草核基因組，在再生煙草植株的葉片蛋白中檢測(cè)到具有活性的人干擾素α-2b蛋白；構(gòu)建了煙草葉綠體定點(diǎn)整合載體，為以煙草葉綠體表達(dá)人干擾素α-2b蛋白做好了前期準(zhǔn)備。
　　 本文全面統(tǒng)計(jì)分析研究了已完成測(cè)序的藻類，苔蘚，蕨類，裸子，被子植物的各物種的核基因組和細(xì)胞器基因組的相關(guān)信息。分別比較了不同物種的基因組大小，基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)的大小變化趨勢(shì)。在174種葉綠體基因組已測(cè)序的物種中，有26種

5、核基因組也完成了測(cè)序，分別比對(duì)各物種的葉綠體基因組和它的核基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著物種越來(lái)越高等，其葉綠體基因在核基因組中的同源性也越來(lái)越高，有5種被子植物的同源性高達(dá)100％。對(duì)15種線粒體基因組和核基因組都已測(cè)序的物種進(jìn)行同樣的全序列比對(duì)，也發(fā)現(xiàn)了隨物種進(jìn)化逐漸增高的趨勢(shì)，但與葉綠體相比，不是太明顯，最高的同源比例僅為82.6％。本文對(duì)藻類、雙子葉植物和單子葉植物的葉綠體的保守基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。將單子葉植物保守基因中沒(méi)有的藻類的保守基因分

6、別與擬南芥和水稻的核基因組比對(duì)分析，其中絕大多數(shù)遺傳系統(tǒng)基因都成功轉(zhuǎn)移，而光合系統(tǒng)和生物合成系統(tǒng)則都丟失了相當(dāng)一部分基因。還對(duì)擬南芥和水稻的葉綠體基因和線粒體基因在核基因組中的同源比例和拷貝數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。綜合分析這些序列的信息后，我們提出以下假設(shè)，在植物進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)胞器基因到核基因組的轉(zhuǎn)移，大致經(jīng)過(guò)了先以拷貝的形式轉(zhuǎn)移到核基因組的非編碼區(qū)，而后獲得表達(dá)功能，細(xì)胞器中相應(yīng)基因的消失進(jìn)而使細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)逐步轉(zhuǎn)移到核基因組中，最終實(shí)現(xiàn)核基