紅霉素對煙草煙霧刺激下沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的影響.pdf

1、本文分析了紅霉素對煙草煙霧刺激下沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的影響。本研究分為三個部分：
　　第一部分：紅霉素對煙草煙霧暴露下人巨噬細胞釋放活性氧及炎癥因子的作用。
　　目的：⑴觀察煙草煙霧刺激對人巨噬細胞產(chǎn)生活性氧的影響，以及紅霉素能否調(diào)控由煙草煙霧暴露介導(dǎo)的人巨噬細胞活性氧（ROS）釋放。⑵觀察煙草煙霧刺激條件下，人巨噬細胞釋放的白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平改變

2、，以及紅霉素對于煙草煙霧暴露下人巨噬細胞釋放炎癥因子水平的影響。
　　方法：研究對象為人淋巴瘤單核細胞株U937，經(jīng)10nM佛波酯（PMA）誘導(dǎo)24h后，U937轉(zhuǎn)換成巨噬細胞，用香煙煙霧提取物（CSE）刺激人巨噬細胞。用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測CSE及紅霉素對細胞最適宜作用濃度。細胞分組：對照組，CSE組（加入1％CSE孵育24h），CSE+紅霉素24h組（1μg/ml紅霉素預(yù)孵育24h后，加入1％CSE繼續(xù)刺激24h），

3、CSE+紅霉素48h組（1μg/ml紅霉素預(yù)孵育48h后，加入1％CSE繼續(xù)刺激24h）。各細胞組在紅霉素（Erythromycin，EM）、CSE干預(yù)下，以2',7'-二氯二氫熒光素二乙酯（2’,7’-dichlorofluorescin-diacetate，DCFH-DA，10mM）作為熒光探針，流式細胞術(shù)檢測各組細胞中ROS水平。用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各實驗組細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α釋放水平。

4、　　結(jié)果：1%濃度的CSE能顯著上調(diào)人巨噬細胞ROS的釋放（P<0.01），紅霉素（1ug/ml）預(yù)孵育24h、48h能抑制1%CSE對細胞ROS的上調(diào)作用（p<0.01），SIRT1特異性抑制劑（NAM）顯著上調(diào)人巨噬細胞ROS的釋放（P<0.01）；CSE1%增加人巨噬細胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α，紅霉素（1ug/ml）預(yù)孵育24h減少IL-6、TNF-α釋放（p<0.01）。紅霉素（1ug/ml）預(yù)孵育48h對人巨噬細胞

5、釋放IL-6、IL-8、TNF-α的抑制作用更加明顯（p<0.01）。
　　結(jié)論：⑴煙草煙霧刺激引起人巨噬細胞釋放活性氧增多，紅霉素抑制氧化應(yīng)激機制之一是通過抑制活性氧釋放。⑵煙草煙霧刺激促進人巨噬細胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α增加，紅霉素抑制炎癥機制之一通過抑制人巨噬細胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α。
　　第二部分：紅霉素對煙草煙霧刺激下人巨噬細胞內(nèi)SIRT1、NF-κB蛋白表達及兩種蛋白之間的相互作用。

6、r>　　目的：觀察人巨噬細胞中SIRT1及NF-κB蛋白表達在煙草煙霧暴露條件下的改變，以及紅霉素對煙草煙霧刺激條件下SIRT1和NF-κB蛋白表達產(chǎn)生何種影響。觀察人巨噬細胞中SIRT1及NF-κB蛋白是否存在相互作用，以及在煙草煙霧暴露、紅霉素治療下，存在何種相互作用關(guān)系。
　　方法：⑴用10nmol/ml PMA孵育24h可將人淋巴瘤單核細胞株U937誘導(dǎo)分化成巨噬細胞，用CSE刺激巨噬細胞，制造細胞在煙草煙霧暴露氧化應(yīng)激模

7、型。分為：對照組，CSE組，CSE+紅霉素24h組，CSE+紅霉素48h組，NF-κB蛋白特異性抑制劑PDTC組（20nM PDTC預(yù)孵育24h后加入1％CSE繼續(xù)孵育24h），SIRT1特異性抑制劑NAM組（20mM NAM孵育24h）。用westernblot（WB）方法檢測各組細胞中NF-κB、SIRT1蛋白表達。⑵將U937誘導(dǎo)分化成巨噬細胞后，對細胞分組并進行實驗。分為：對照組，CSE組，CSE+紅霉素24h組，CSE+紅霉素

8、48h組。提取各組細胞總蛋白，先用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）進行蛋白沉淀，再用westernblot（WB）方法檢測各組細胞中NF-κB、SIRT1蛋白表達。
　　結(jié)果：1.CSE暴露會導(dǎo)致人巨噬細胞中SIRT1蛋白表達明顯下降，并能增加NF-κB蛋白表達，經(jīng)紅霉素預(yù)孵育24h后再予CSE刺激，能促進人巨噬細胞中SIRT1蛋白表達升高，同時抑制NF-κB蛋白表達升高，經(jīng)紅霉素預(yù)孵育48h

9、后，對人巨噬細胞中SIRT1蛋白表達升高以及對NF-κB蛋白的抑制作用更加明顯。
　　結(jié)果：①CSE暴露會導(dǎo)致人巨噬細胞中SIRT1蛋白表達明顯下降，增加NF-κB蛋白表達，經(jīng)紅霉素預(yù)孵育24h、48h，均促進人巨噬細胞中SIRT1蛋白表達升高，同時抑制NF-κB蛋白表達升高，其中48h組更明顯。②經(jīng)Co-IP檢測，SIRT1和NF-κB蛋白在人巨噬細胞內(nèi)存在直接相互作用，CSE刺激可導(dǎo)致SIRT1蛋白表達減少，從而促進NF-κB

10、蛋白表達增加，經(jīng)紅霉素預(yù)孵育24h、48h，可增加人巨噬細胞中SIRT1蛋白表達，抑制NF-κB蛋白表達。
　　結(jié)論：⑴煙草煙霧導(dǎo)致炎癥的機制可能是通過氧化應(yīng)激抑制人巨噬細胞SIRT1蛋白表達，進而促進NF-κB蛋白表達，從而促進炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、TNF-α釋放。⑵紅霉素抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥機制可能是通過紅霉素增加SIRT1蛋白表達，進而抑制NF-κB蛋白表達，從而抑制炎癥介質(zhì)釋放。
　　第三部分：紅霉素對煙草煙

11、霧暴露小鼠肺組織以及肺組織中SIRT1與NF-κB蛋白作用。
　　目的：觀察煙草煙霧暴露對小鼠肺組織的影響，以及紅霉素對煙草煙霧暴露小鼠肺組織的作用。觀察受煙草煙霧暴露刺激小鼠的肺組織中SIRT1及NF-κB蛋白表達的改變，以及紅霉素對煙草煙霧刺激下對小鼠肺組織內(nèi)SIRT1及NF-κB蛋白表達的作用。
　　方法：將8周大小的雄性BALB/c小鼠分為：對照組，煙草煙霧暴露組，紅霉素治療組。煙草煙霧暴露組每天煙草煙霧暴露2h，持

12、續(xù)12w，紅霉素治療組在煙草煙霧暴露前用紅霉素（100mg/kg·day）灌胃治療，余處理同煙草煙霧暴露組。建模到期后取右肺組織切片行HE染色，剩余肺組織行westernblot檢測各組小鼠肺組織中NF-κB、SIRT1蛋白表達。
　　結(jié)果：⑴煙草煙霧暴露小鼠肺組織中出現(xiàn)炎癥，支氣管周圍炎癥細胞聚集，肺組織出現(xiàn)肺氣腫表現(xiàn)。紅霉素治療組炎癥反應(yīng)較煙草煙霧暴露組減輕，肺氣腫表現(xiàn)減輕。⑵煙草煙霧暴露小鼠肺組織中SIRT1蛋白較對照組明顯